הזרקת וקטור ויראלי לחוט השדרה של החולדה למעקב עצבי לאחור

תקציר

מקור: Keefe, K. M., et al. הזרקה ישירה של וקטור לנטי-ויראלי מדגישה מסלולים מוטוריים מרובים בחוט השדרה של החולדה. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את הזרקת וקטור ויראלי יעיל ביותר להובלה לאחור (HiRet) לחוט השדרה של החולדה כדי לעקוב אחר מסלולים עצביים. לנגיף יש גליקופרוטאינים לכניסה סינפטית וגן מקודד חלבון פלואורסצנטי. המחט מוחדרת לחוט השדרה, ותרחיף הנגיף ניתן בקצב מבוקר. המחט נשלפת לבסוף לאחר מתן מספיק זמן לדיפוזיה ויראלית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. תכשירים טרום ניתוחיים

1. הכינו מחטי זכוכית משוכות להזרקה ויראלית מספר ימים לפני הניתוח באמצעות פיפטות נימי זכוכית בנפח 3.5 ננו-ליטר המיועדות למזרקי ננו-ליטר. משוך כל פיפטה על מושך מחט דו-שלבי בהתאם להוראות היצרן ליצירת תבניות דו-מחטיות.
2. צמצם את קצה תבניות המחט על ידי חיתוך כ-1-2 מ"מ של עודפי זכוכית בעזרת מספריים. מדוד את גודל הצמצם המשוער תחת מיקרוסקופ עם שקופית כיול מיקרוסקופ כדי לבודד מחטים עם צמצמים של 30-40 מיקרומטר.
3. כאשר המחט ממוקמת ב-30°, השתמש בשיפוע מיקרופיפטה כדי ליצור קצה עם צמצם של 30-40 מיקרומטר וזווית משופעת של 45°. ודא את רוחב הצמצם באמצעות סולם Vernier בשקופית הכיול. העבירו מים ואתנול דרך מחט הזכוכית באמצעות מזרק עם חיבור מחט גמיש כדי לשטוף פסולת ולסמן את המחט במרווחי זמן קבועים בטוש שחור.
4. מניחים את המחטים בצלחת פטרי מכוסה שנוקה בעבר עם 70% אתנול ומעקרים למשך 30 דקות בקולט אדים תחת אור אולטרה סגול או UV.
5. הכן וירוס הובלה לאחור יעיל ביותר (HiRet) על ידי הוצאת נפח מתאים מהמקפיא מיד לפני ההליך.
   הערה: נפח מתאים כולל את הכמות הדרושה להזרקה (1 מיקרוליטר לכל הזרקה x מספר זריקות) בתוספת כמות קטנה של נפח נוסף כדי לקחת בחשבון הפסדי פיפטינג וטעינה. הובלה ואחסון של הנגיף על קרח כאשר אינו בשימוש.
6. הכן את המזרק על ידי חיבורו למיקרו-משאבה והכנסתו למיקרומניפולטור עם סולם ורנייה.
7. להכנת מחט הזכוכית, טען בזהירות צבע צבעוני כמו שמן אדום עם מזרק המצויד במחט גמישה. ודא שלא יישארו בועות במחט. השתמש בטכניקה אספטית בעת הטיפול במחט, והימנע מלגעת בקצה.
8. הכנס את מחט הזכוכית לתוך המזרק, וודא שהמחט יושבת כהלכה לתוך הדסקיות, מכסה המזרק מוברג בחוזקה, ומחט מזרק הפלדה מורחבת בערך 3/4 מאורך מחט הזכוכית. ניתן לטעון וירוסים לתוך המחט בשלב מאוחר יותר.

2. הרדמה והכנת אתר כירורגי

1. שקלו את החיה במשקל דיגיטלי. רשום את המשקל לפני הניתוח כדי לקבוע את נפח ההרדמה הנדרש ולאפשר מעקב אחר המשקל לאחר הניתוח. נקבות חולדות Sprague-Dawley, כ-200-250 גרם, שימשו בפרוטוקול זה.
2. להרדים את החולדה באמצעות שאיפת איזופלורן או תמיסת קטמין/קסילזין בהזרקה (k/x). כאן, קטמין מוזרק תוך צפקי במינון של 67 מ"ג/ק"ג וקסילזין במינון של 6.7 מ"ג/ק"ג.
3. אשר מישור הרדמה מתאים על ידי צביטה חזקה של כף הרגל. אם מתרחשת נסיגה רפלקסיבית, המתן מספר דקות נוספות לפני שתמשיך.
   הערה: שים לב גם לשפם, לעיניים ולקצב הנשימה לאיתור סימני הכרה. אם השפם מתעוות, העין ממצמצת כשנוגעים בה בעדינות, או שהנשימה מהירה ורדודה, המתן עד שמישור ההרדמה יהיה עמוק יותר כדי להמשיך בפרוטוקול. כמו כן, עקוב אחר סימנים אלה לאורך כל ניתוח כריתת הלמינקטומיה וההזרקה. אם החיה מציגה מישור הרדמה רדוד, תן זריקת דחף של קטמין בלבד השווה ל-1/2 מהמינון המקורי k/x.
4. גלח את החולדה לאורך קו האמצע הגבי מהמותניים לזווית התחתונה של עצם השכמה. משוך את עור בעל החיים מתוח לגילוח קל ומדויק יותר.
5. יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים.
6. מרחו חומר חיטוי על האזור המגולח כדי לעקר את האתר. לקרצוף הראשון יש להשרות גזה סטרילית בתמיסת יוד של 5% ולנגב את כל השיער והפסולת. עקוב אחר זה עם החלקה חד כיוונית עם גזה סטרילית ספוגה באתנול 70% כך שלא ייווצר קשר עם אזור פעמיים. השתמש באותה טכניקה עם יוד וגזה ספוגה באתנול לסירוגין פעמיים נוספות.

3. הכנת שדה כירורגי ומכשירים

1. הכינו סט של כלים כירורגיים חיטויים הכוללים אזמל, רונג'ורים, מלקחיים לשיני חולדה, מספריים קפיציים, המוסטטים, מלקחיים מעוקלים בנקודה בינונית ומחזירים או ווים משוקללים על ידי פתיחת העטיפה הסטרילית ליצירת שדה סטרילי.
2. פתחו חבילה של כפפות כירורגיות סטריליות והניחו את עטיפת הכפפה הסטרילית על השולחן. השתמש בזה כשדה סטרילי נוסף לכלים משומשים כדי למנוע זיהום של העטיפה הסטרילית.
3. זרוק להב אזמל #10 על השדה הסטרילי. אבטח את הלהב לידית עם המוסטטים. מקם תמיסת מלח סטרילית, תפר מעי כרומי 4.0 וחומרים לשליטה בדימום כגון צריבה סטרילית, גזה סטרילית, אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה (לדימום שרירים), או קצף ג'ל או שעוות עצם (לדימום עצמות) במקום נגיש.
4. הוציאו את החיה והניחו אותה על בד סטרילי. הניחו גזה מתחת לשלפוחית השתן כדי לאסוף שתן. תמכו באזור היעד עם מגבת מגולגלת מתחת לבטן. אם זמין, הנח כרית חימום כירורגית מתחת לבד הסטרילי, במיוחד עבור הליכים ארוכים יותר.
   הערה: סטריליות חשובה במהלך ניתוח הישרדות. שמור בקבוק ריסוס של 70% אתנול בהישג יד כדי לשמור על סטריליות הידיים עטויות הכפפות, ומעקר חרוזים לשימוש אם סטריליות המכשיר נפגעת, או בין ניתוחים בודדים.

4. חשיפת עמוד השדרה וזיהוי אתר כריתת הלמינקטומיה

1. זהה את האזור בו יבוצע חתך בעור על ידי לחיצה עדינה על האצבעות בצלע האחרונה כדי לאתר את חוליית העץ או L1. השתמש בזה כציון דרך, בצע חתך עור של 3-4 ס"מ עם אזמל כירורגי #10 שמסתיים רק נחות מ-L1 כדי לחשוף את השריר. החזק את העור מתוח על ידי פיזור עדין ולחיצה חזקה עם להב האזמל כדי להבטיח חתך נקי.
2. חותכים ומורחים שומן שטחי בעזרת מלקחיים ומספריים במידת הצורך. (בהתאם לחוליית המטרה, ייתכן שיש כרית שומן גדולה שטחית לשריר או לא.)
3. הרגישו את התהליכים הקוצניים עם השטוח של להב האזמל או האצבע. לעתים קרובות, אזור קו האמצע יתואר על ידי "V" של פאשיה לבנה משני הצדדים. בצע חתך רוסטרלי קטן כדי לאפשר מקום לתפוס בבטחה על תהליך עליון עם מלקחיים של שן חולדה, ואז בצע שני חתכים ארוכים ועמוקים קרוב ככל האפשר לתהליכים. בנקודה העמוקה ביותר של החיתוך ניתן להרגיש את המשטח הגבי של החוליות בעזרת להב האזמל.
4. החזק את השרירים הצדדיים בצד עם מחזירים או ווים משוקללים כדי לשפר את הראות. נקה שריר סביב התהליכים בעזרת אזמל, מספריים קפיציים או רונג'ורים כדי לקבוע את צורת ראשם.
   הערה: זכור שחוט השדרה אינו מאריך את כל אורך עמוד השדרה מכיוון שרקמת חוט השדרה מפסיקה לצמוח מוקדם יותר בהתפתחות מאשר העצם. המשמעות היא שרמת עמוד השדרה המטרה עשויה להיות מתחת לחוליה בשם שונה.
5. אתר את בית החזה או T11 ואת תהליכי T12 ו-T13 הסמוכים.
   הערה: סיוע בהתמקדות ברמות חוליות נכונות ניתן למצוא באטלס חוט השדרה של חולדה ובמחקרים קודמים המתארים ציוני דרך בעכבר, שיש לו מבנה חוליות דומה מאוד6,33. השאירו תהליך קוצני רוסטרלי, כגון T9, ללא הפרעה כדי לתת ציון דרך בקו האמצע.

5. ביצוע כריתת למינקטומיה

1. לאחר שאזור המטרה זוהה כהלכה, בצע למינקטומיה של ההיבטים הגביים של T11-T13. פרשו בעדינות את החוליות כדי לחשוף רצועות בין חולייתיות, שהן אתרים טובים להחדרת רונג'ורים לנשיכה הראשונית של העצם. החזק את ה-rongeurs במצב סגור למחצה כדי להגביר את השליטה העדינה.
2. הסר את התהליכים הקוצניים ואת ההיבט הגבי של החוליות על ידי נשיכות קטנות עם הרונג'ורים. היזהר לא לפגוע בחוט השדרה או להפריע לדורה. הרם מעט עם מלקחיים של שן החולדה כדי לעזור למשוך את חוט השדרה הרחק מהחוליות ולהפחית את הנטייה לפגוע ברקמת חוט השדרה.
3. נקה את העצם מקו האמצע כך שניתן יהיה לצפות בכלי הדם בקו האמצע. השאירו חלון שמראה בבירור את רקמת חוט השדרה ונקי מפסולת.
4. גע בעדינות בחוט השדרה בעזרת מלקחיים. חלק מבעלי החיים עשויים לקפוץ באופן רפלקסיבי גם אם מישור ההרדמה שלהם עמוק. מרחו כמה טיפות של חומר מאלחש, כגון לידוקאין, ישירות על חוט השדרה כדי למנוע קפיצה במהלך הליך ההזרקה.
5. אבטח את החיה במחזיק עמוד השדרה על ידי הידוק מלקחיים מייצבים לתהליכים הקוצניים רוסטרל וזנב לחלון כריתת הלמינקטומיה. הרם את בטן החיה באמצעות מחזיק עמוד השדרה כדי לשלול את השפעת תנועות הנשימה. זה יגביר את יציבות המחט ויבטיח את עומק ההזרקה המתאים.

6. טעינת הנגיף ומיקום המזרק

1. טען את הנגיף לתוך המזרק על ידי פיפטינג של כ-5 מיקרוליטר על פיסת פרפילם ומיקום המחט כך שהקצה יהיה בתוך הטיפה.
2. השתמש במיקרו-משאבה כדי למשוך עד 4 מיקרוליטר של וירוס בקצב של 20-100 nL/s.
3. הגדר את הבקר להזריק ולשחרר כמות קטנה של וירוס מהמחט כדי להבטיח שקצה המחט אינו חסום. נגב עודפי וירוס עם מגבון מעבדה.
   הערה: מזרק המילטון עם מחט פלדה עשוי לשמש כחלופה לפיפטות זכוכית משוכות.
4. מקם את המיקרומניפולטור כך שסולם ורנייה יהיה גלוי, ומקם את המחט בקו האמצע של חוט השדרה.
   הערה: לפעמים ניתן לאתר את קו האמצע על ידי כלי דם גדול העובר על המשטח הקדמי של חוט השדרה. עם זאת, זה יכול להשתנות בחולדות בודדות, ויש לאשר את מיקוד קו האמצע על ידי השוואה לתהליך קוצני שלם.
5. כוון את המחט לרוחב ב-0.8 מ"מ באמצעות סולם ורנייה במיקרומניפולטור.
6. הורד את המחט לחוט השדרה עד שהיא נכנסת, אך לא מנקבת, את הדורה. בעזרת תנועת פיתול מהירה, נקבו את הדורה עם המחט עד שהיא שקעה לעומק של 1.5 מ"מ.

7. הזרקת הנגיף לחוט השדרה

1. לאחר שהמחט נמצאת במקומה, תכנת את המזרק להזריק בקצב של 400 נ"ל לדקה. ודא שהנגיף נכנס לחוט השדרה על ידי התבוננות בהתקדמות חזית הצבע. לא אמורה להיות דליפה או בליטה ברורה של רקמת חוט השדרה. אם נצפתה דליפה, לפעמים ניתן להקל על כך על ידי הפחתת מהירות ההזרקה ל-200 nL/min.
2. לאחר סיום ההזרקה, אפשר למחט לנוח בחוט השדרה למשך 2-5 דקות (תלוי בנפח המוזרק) כדי להקל על דיפוזיה של הנגיף.
3. משוך לאט את המחט ועבור לאתר ההזרקה הבא. הזרקו 1 מיקרוליטר של נגיף לכל אחד מ-6 האתרים המרוחקים כ-1 מ"מ זה מזה לאורך רקמת עמוד השדרה L1-L4. ניתן להשתמש באותה מחט לכל זריקה כל עוד היא ממשיכה לתפקד כראוי.

8. סגירת פצע וטיפול לאחר הניתוח

1. הסר את החיה ממחזיק עמוד השדרה והוציא מחזירים או ווים המשמשים לפיזור שרירים לרוחב. ודא שהפצע נקי מכל פסולת לפני הסגירה.
2. תפרו את השריר באמצעות תפר קטגוט כרומי 4.0. חותכים חוטי תפרים קרוב לקשר כדי להפחית את הסבירות לגירוי פנימי בעור.
3. מהדקים את העור סגור באמצעות קליפסים של 9 מ"מ לפצע. כדי לאפשר ריפוי מיטבי, יש ליישר את קצוות העור לפני ההידוק.
4. הנח את החיה על כרית חימום הסעת מים ופקח עד להתעוררות.
5. יש להזריק 5-10 מ"ל של מי מלח סטריליים תת עוריים לחידוש נוזלים ואנטיביוטיקה כגון צפזולין למניעת זיהום. כאשר בעל החיים אמבולטורי, החזירו אותו לכלוב הביתי שלו וספקו משככי כאבים ראשוניים. עקוב אחר החולדות לאיתור כל סימן של כאב ומצוקה, וטפל בהתאם לנוהל המאושר של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לשיכוך כאבים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
#10 להבי אזמל	Roboz	RS-9801-10	לשימוש עם אזמל.
מזרקים של 1 מ"ל	בקטון, דיקינסון ושות	309659	להזרקת IP להרדמה, זריקות דחף פוטנציאליות להרדמה וזריקות אנטיביוטיקה.
מזרקים של 10 מ"ל	בקטון, דיקינסון ושות	309604	להזרקת מי מלח לבעל החיים, לאחר הניתוח.
4.0 תפר כרומי Catgut	DemeTECH	NN374-16	לקשירת שריר מחדש במהלך הסגירה.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	משמש לשיפוע קצות צינורות נימי הזכוכית הנמשכים ליצירת מחטי זכוכית פונקציונליות.
5% תמיסת יוד	Purdue Products L.P.	L01020-08	לשימוש בעיקור של אתר הניתוח.
70% אתנול	N/A	N/A	לעיקור מחטי זכוכית שהוכנו לאחרונה, מודלים של בעלי חיים במהלך ההכנה הכירורגית וידי המנתח במהלך הניתוח, כמו גם כל שאר השמירה הקלה על סטריליות.
חומר הרדמה (תמיסת קטמין/קסילזין)	Zoetis	240048	לשמירה על בעל החיים במישור ההכרה הנכון במהלך הניתוח.
אנטיביוטיקה (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	להזרקה תת עורית למניעת זיהום לאחר הניתוח.
מעקר חרוזים	CellPoint	5-1450	לעיקור חום של מכשירים כירורגיים.
שעוות עצם	Fine Science Tools	19009-00	לאיטום עצם במקרה של דימום בעצם.
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	לאיטום עורקים או ורידים שנחתכו במהלך הניתוח כדי למנוע אובדן דם מוגזם.
משקל דיגיטלי	Okaus	REV.005	לשקילת החיה במהלך ההכנה הכירורגית.
חיבור מחט גמיש	World Precision Instruments	MF34G-5	לניקוי מחטי זכוכית והעמסת שמן אדום למחטי זכוכית.
קצף ג'ל	פייזר	H68079	לאיטום עצם במקרה של דימום בעצמות.
צינורות נימי זכוכית	World Precision Instruments	4878	למחטי זכוכית משוכות - יש לתכנן עבור מזרקי ננו-ליטר.
קוצץ שיער	אוסטר	111038-060-000	לניקוי אזור הניתוח משיער.
המוסטטים	Roboz	RS-7231	לשימוש כללי בניתוחים.
Kimwipes	Kimtech	34155	לשימוש כללי בניתוחים.
מלקחיים מעוקלים בנקודה בינונית	Roboz	RS-5136	לשימוש כללי בניתוחים.
מיקרומניפולטור עם סולם Vernier	Kanetec	N/A	למיקוד מדויק במהלך הניתוח.
מספריים מיקרו Roboz		RS-5621	לחיתוך לחישות זכוכית מצינורות נימי זכוכית טריים שנמשכו.
מיקרוסקופ עם אור וסולם ורניר Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	משמש להדמיה ומדידה של שיפוע של צינורות נימי זכוכית משוכים לתוך מחטי זכוכית פונקציונליות.
בקר משאבת MicroSyringe	World Precision Instruments	62403	לשליטה בקצב ההזרקה.
Nanoliter 2000 מזרק ראש משאבה	World Precision Instruments	500150	לטעינה והזרקת וירוס בצורה מבוקרת.
חולץ מחטים	Narishige	PC-100	לחימום ופירוק צינורות נימי זכוכית ליצירת מחטי זכוכית.
משחת עיניים	Dechra מוצרים וטרינריים	RAC 0119	להגנה על עיני החיה במהלך הניתוח.
Parafilm	Bemis	PM-996	כדי לסייע בהעמסת הנגיף לתוך הננו-מזרק.
מחטי PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	לשימוש עם מזרקי 1 מ"ל ו-10 מ"ל כדי לאפשר הזרקה של דגם החיה.
מלקחיים לשן חולדה	Roboz	RS-5152	לאחיזה בתהליכים קוצניים.
שמן אדום	N/A	N/A	לספק חזית להדמיה של הנגיף הנכנס לרקמה במהלך ההזרקה.
מחזירים	Roboz	RS-6510	כדי להחזיק את פצע הניתוח פתוח.
טבליות רימדיל	Bio Serv	MP275-050	לטיפול בכאב לאחר הניתוח.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	להסרת שריר מעמוד השדרה במהלך הניתוח.
ידית להב אזמל	Roboz	RS-9843	לפרוס עור פתוח וכרית שומן של דגם בעלי חיים במהלך הניתוח.
מספריים	Roboz	RS-5980	לשימוש כללי בניתוחים.
קליפס פצע גניבת אל חלד	CellPoint	201-1000	כדי לקשור את עור הפצע הניתוחי במהלך הסגירה.
מלקחיים להסרת סיכות	קנט סיינטיפיק	INS750347	כדי להסיר את הסיכות, אם יש ליישם אותם בצורה לא נכונה.
בד סטרילי	Phoenix Research Products	BP-989	כדי לספק משטח סטרילי לניתוח.
אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה	Puritan	806-WC	לספיגת דם בפצע הניתוחי תוך שמירה על סטריליות.
גזה סטרילית	Covidien	2146	לניקוי אזור הניתוח וכלי הניתוח תוך שמירה על סטריליות.
תאגיד הבריאות בקסטר	סטרילי	281324	לשימוש בניקוי דם ולהחלפת נוזלים לאחר ניתוח.
כפפות כירורגיות	N/A	N/A	לשימוש על ידי המנתח לשמירה על שדה סטרילי במהלך הניתוח.
כרית חימום כירורגית	N/A	N/A	לשמירה על טמפרטורת הגוף של דגם החיה במהלך הניתוח.
מיקרוסקופ כירורגי	N/A	N/A	להדמיה משופרת של הפצע הניתוחי.
מהדק כירורגי	קנט סיינטיפיק	INS750546	למרוח את הסיכות.
משאבת מים לטיפול בחום T / Pump	Gaymar	TP500C	כדי לשאוב מים חמים לתוך כרית חימום הסעת המים.
כרית חימום הסעת מים	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	לשימוש באזור ההתאוששות לאחר הניתוח לשמירה על טמפרטורת הגוף של החיה חסרת ההכרה.
ווים משוקללים	N/A	N/A כדי	להחזיק את פצע הניתוח פתוח.

' '