אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה לחסימת פוטנציאל פעולה עצבית במודל חולדה סוכרתית

תקציר

מקור: Lee, Y. F., et al. כלי אולטראסוני לחסימת הולכה עצבית במודלים של חולדות סוכרתיות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את השימוש באולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HIFU) כדי לחסום פוטנציאל פעולה מהעצב הסיאטי לשריר הגסטרוקנמיוס במודל חולדה סוכרתית. עם העברת קרן ה-HIFU לעצב, ירידה באות השריר מאשרת את הפוטנציאל של HIFU כטיפול לא פולשני לשיכוך כאבים נוירופתיים סוכרתיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. חסימת הולכה עצבית in vivo עם מתמר אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HIFU)

הערה: הניסוי in vivo מתחיל בשבוע 5 לאחר הזרקת סטרפטוזוטוצין (STZ) של 50 מ"ג/ק"ג.

1. בצע הליכים בבעלי חיים לפני חסימת פוטנציאל פעולת השרירים המורכבים (CMAPs) עם סוניקציה של HIFU.
   1. יש לעקר את כלי הניתוח (אזמל, מספריים, מלקחיים וו זכוכית) בחיטוי לפני הניתוח.
   2. להרדים את החולדות באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת טילטמין/זולאזפאם (40 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) או באמצעות שאיפה של 1.75% איזופלורן באמצעות מכשיר אידוי איזופלורן. הניחו את החולדות על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלהן.
   3. מקם את החולדות לניתוח בשכיבה גחונית. יש למרוח את משחת העיניים. האריכו את רגל החולדה וצבטו את פני השטח של כף הרגל בעזרת ציפורניים כדי לוודא את עומק ההרדמה. אם החולדות מראות תגובות נסיגה, יש להחיל הרדמה נוספת.
   4. הסר שיער מהירך והגב התחתון של החולדות בעזרת קוצץ חשמלי. מרחו יוד נוזלי עם גזה נקייה באתר הניתוח והעבירו את הגזה באופן מעגלי החוצה מאתר הניתוח. השתמש בפד אלכוהול כדי לנגב את היוד הנוזלי באותה תנועה מעגלית. ניסוי זה מבוצע באתרי הניתוח השמאלי והימני. חזור על ההליך באתר הניתוח השני בעת ביצוע השלב הבא של ההליך.
   5. השתמש במספריים כירורגיים סטריליים או באזמל כדי לבצע חתך של העור בירך הגב. השתמש במספריים כירורגיים קהים כדי להפריד בזהירות את הרקמה מתחת לעור ולאבטח את העור עם ווים לעור. ניתן לראות את עצם הירך בתוך השרירים.
   6. השתמש במספריים כדי להפריד בזהירות את השרירים המקבילים לעצם הירך עד לסיבי העצב הסיאטיים באמצע הירך המוטבעים בשרירים. השתמש בזהירות בוו זכוכית כדי להפריד את העצב הסיאטי באמצע הירך מרקמות החיבור והשרירים שמסביב.
2. מקם את העצב הסיאטי באזור המוקד של HIFU באמצעות מקבע עצבים מותאם אישית (איור 1 ואיור 2).
   הערה: מקבע העצבים בהתאמה אישית מורכב מ-3 רכיבים (איור 2). כל הרכיבים עשויים מפולימתיל-מתאקרילט שקוף (PMMA). התבריג החיצוני של המבנה העליון של רכיב I הוא בגובה 2.5 מ"מ ו- M10XP0.7 (איור 3A). הבאר המרכזית היא חור בקוטר 4.0 מ"מ דרך רכיב I. הפתח התחתון של הבאר אטום על ידי יריעת סרט. קוטר החריץ הוא 1.2 מ"מ, והמרחק בין המישור המרכזי של החריץ למשטח העליון של רכיב I הוא 3.1 מ"מ. רכיב II מורכב מגוף ראשי, ארבע רגליים והמבנה התחתון (איור 3B). החוט הפנימי של המבנה התחתון הוא בגובה 2.5 מ"מ ו-M10XP0.7 כדי להתאים לתבריג החיצוני של רכיב I. קוטר החור המרכזי זהה לבאר המרכזית של רכיב I. מידות הגוף הראשי הן קוטר 32 מ"מ ועובי 5.4 מ"מ. ארבע רגליים פרוסות באופן סימטרי. שתי רגליים קצרות זהות מיועדות ליישור, ושתי רגליים ארוכות זהות משמשות לחיבור ברכיב III. הקוטר החיצוני והגובה של רכיב III הם 41 מ"מ ו-9.2 מ"מ. התבריג הפנימי הוא M36XP1.0, והחור-עובר הוא בקוטר 27.5 מ"מ (איור 3C). החרוט הוא מחודד חלול עם פתח עליון בקוטר 84 מ"מ ופתח תחתון בקוטר 27.5 מ"מ. הגובה הוא 57.5 מ"מ (איור 4A).
   1. לפני הניסוי יש להשרות את מקבע העצבים האקרילי בהתאמה אישית בתמיסת אקונומיקה למשך 30 - 60 דקות, ולאחר מכן להשרות במים סטריליים.
   2. בעזרת וו זכוכית, הרם את העצב בזהירות והכניס אותו לחריץ של רכיב I.
   3. הברג את רכיב II לרכיב I. מלא את הבאר המרכזית של רכיב I בתמיסה של רינגר להתפשטות אולטרסאונד ושימור עצבים.
   4. הברג את רכיב III לקונוס הדיור של HIFU. עגינה של רכיב III עם רכיב II דרך ארבע הרגליים של רכיב II.
      הערה: המרכז הגיאומטרי של שלושת הרכיבים והמתמר מיושרים. המרחק בין העצב למתמר שווה לאורך המוקד, מה שמבטיח שהעצב נמצא בתוך אזור המוקד של HIFU.
3. הכנס זוג אחד של מחטי דיקור למקור העצב הסיאטי ואת הזוג השני לשריר הגסטרוקנמיוס. חבר כל זוג מחטים למערכת הרכישה האלקטרופיזיולוגית באמצעות כבל קואקסיאלי חשמלי (איור 1).
   הערה: בקצה אחד של הכבל ישנם שני מהדקי תנין כדי להצמיד שתי מחטים בנפרד, ובקצה השני של הכבל נמצא מחבר כידון Neill-Concelman (BNC) לקישור המערכת. זוגות מחטי הדיקור פועלים כאלקטרודות מגרות בעצב הסיאטי ואלקטרודות ההקלטה בשריר הגסטרוקנמיוס.
   1. הגדר את קצב הדגימה ורוחב הפס של מערכת רכישת האלקטרופיזיולוגיה ל-50 קילו-הרץ ו-70 הרץ-3 קילו-הרץ, בהתאמה. הפעל גירוי על-מקסימלי ברוחב דופק של 0.1 אלפיות השנייה על האלקטרודות המגרות במקור העצב הסיאטי.
   2. הקלט את ה-CMAPs מאלקטרודות ההקלטה והגביר את ה-CMAPs עם המגבר המובנה במערכת רכישת האלקטרופיזיולוגיה.
      הערה: השתמש במגבר המובנה במערכת רכישת האלקטרופיזיולוגיה כדי להגביר את אותות העצבים ולהקליט את ה-CMAPs מאלקטרודות ההקלטה עם מערכת רכישת האלקטרופיזיולוגיה.
4. השתמש במתמר HIFU מסחרי של 2.68 מגה-הרץ כדי לדכא את ה-CMAPs בחולדות נוירופתיות סוכרתיות.
   הערה: המפרט של המתמר מתואר כדלקמן: קערה כדורית חד-אלמנטית בקוטר צמצם של 6 ס"מ ואורך מוקד של 5 ס"מ, ואזור מוקד אליפסואיד בעומק 4 מ"מ ורוחב 0.8 מ"מ בשדה החופשי.
   1. טבלו את החרוט הכדורי, מתמר ה-HIFU ומכסה החרוט במיכל המלא במים נטולי גז. הכניסו את מתמר ה-HIFU לתוך החרוט הכדורי וקבעו את מכסה החרוט לפתח העליון של החרוט הכדורי עם שישה ברגי ראש (איור 4B). לאחר הוצאת בועות בחרוט הכדורי באופן טבעי בגלל צפיפות הבועות הנמוכה בהשוואה למים, אטמו את פתח הקצה הקדמי של החרוט עם סרט שקוף בעובי 0.03 מ"מ. הברג את רכיב III על החרוט הכדורי.
   2. הוצא את מתמר ה-HIFU עם החרוט הכדורי ורכיב III ממיכל המים המנותק.
      הערה: מי האוסמוזה ההפוכה (RO) המשמשים במחקר הם המים המטוהרים בתהליך של אוסמוזה הפוכה. מי ה- RO מבושלים כדי להוציא את הגז. לאחר הקירור מתקבלים המים הנטולים במיכל אטום בודד.
5. הכניסו את רכיב I לחלל שבין העצב לשריר בזהירות, ומקמו את העצב ברווח של רכיב I. בצעו את השלבים 1.2.3 ו-1.2.4 כדי להבטיח שהעצב נמצא בתוך אזור המוקד של ה-HIFU (איור 2A).
6. קשר מחולל פונקציות ומגבר הספק בתדר רדיו. חבר את הכוח ampחיים יותר למתמר HIFU כדי ליצור את קרן ה-HIFU. הגדר ידנית את כרךtagפלט של מחולל הפונקציות למתמר HIFU באמצעות הכוח ampחיים יותר. כבה ידנית את מחולל הפונקציות לאחר סיום זמן החשיפה ל-HIFU. התבונן בזמן באמצעות טיימר.
   הערה: העוצמה והאנרגיה של קרן HIFU המשמשת במחקר זה הן 2,810 W/cm² ו-84 J/mm², בהתאמה.
7. במקביל, העבירו את הגירוי דרך מערכת רכישת האלקטרופיזיולוגיה (שלב 1.3) וקרן HIFU דרך מערכת HIFU (שלב 1.6) לעצב הסיאטי תוך כדי רישום ה-CMAPs. הגדל בהדרגה את החשיפה ל- HIFU על העצב הסיאטי מ -3 שניות, 5 שניות ל -8 שניות עד שנצפתה ירידה או עיכוב של משרעת ה- CMAPs.
   1. רשום את ה-CMAPs פעם בשנייה במהלך מסירת קרן ה-HIFU. לאחר התבוננות בשינוי במשרעת של CMAPs, כבה את מערכת HIFU ולחץ ידנית על סמל הרשומה בתוכנת רכישת האלקטרופיזיולוגיה כדי להקליט CMAPs כל 2 דקות בתחילת 10 הדקות, כל 5 דקות ב-30 דקות רצופות וכל 10 דקות בשלב האחרון עד שזמן ההקלטה מגיע לשעתיים.
8. הפרד רכיבים II ו-III של מקבע העצבים (איור 2) כדי להסיר את מתמר ה-HIFU מאתר החתך. הפרד רכיבים II ו-I כדי לשחרר את העצב הסיאטי המאובטח. לתפור את אתר הניתוח של החולדה הסוכרתית עם 4-0 תפרי קטגוט כרומיים לאחר רישום ה-CMAPs. מרחו יוד נוזלי על מקום הניתוח כדי למנוע זיהום.
   1. הנח את הכלובים על כרית החימום ואפשר לחולדות להתאושש בכלובים שלהן לפני החזרתן למתקן החיות. ספקו לחולדות איבופרופן במי שתייה למשך 3 ימים או זריקה תוך-צפקית של בופרנורפין (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג).
9. הכנס אלקטרודות מגרות והקלטה במקור העצב הסיאטי ובשרירי הגסטרוקנמיוס של חולדות נוירופתיות סוכרתיות מורדמות כמתואר בשלבים 1.1.2 ו-1.3 בימים 7, 14 ו-28 לאחר הסוניקציה הראשונית של HIFU.

תוצאות

איור 1: המערך הניסיוני עבור בלוק הולכה עצבית in vivo עם אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HIFU). (A) חרוט כדורי אקרילי בהתאמה אישית שמלא במים נטולי גז באוסמוזה הפוכה שולב עם מקבע העצבים כדי להבטיח שאזור המוקד של מתמ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 acquisition system	Biopac Systems, Inc.
מתמר HIFU	Sonic Concepts	H108
מחולל פונקציות	Agilent	33250A
מגבר כוח	אלקטרוניקה וחדשנות	1040L
חולדות	Biolasco טייוואן	Sprague-Dawley
Puralube משחה וטרינרית	Dechra
Isoflurane וופורייזר	Parkland Scientific
V3000PS Isoflurane	אטאנה