השתלת תאי מבשר בין-נוירוניים למוח של גור עכבר

תקציר

מקור: Quattrocolo, G., et al. השתלה הומוכרונית של מבשרי אינטרנוירונים במוח עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההשתלה של תאים מבשרים בין-נוירוניים למוח העכבר היילוד באמצעות גישה הומוטופית או הטרוטופית. ההליך כולל אבטחת גור מושתל מורדם, זיהוי אזור מוח היעד והזרקת תרחיף של תאים קודמים שמקורם בגור תורם באותו שלב התפתחותי. לאחר ההזרקה, הגור מועבר לכרית חימום להתאוששות, מה שמאפשר הערכה לאחר מכן של הישרדות התא התורם והתבגרותו.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הסרת מוח עכבר P0-P2

1. ממש לפני תחילת ההליך, מלאו מספר צלחות פטרי בנוזל מוחי מלאכותי צונן ופחמימתי (sACSF). מלאו גם את צינורות האיסוף ב~25 מ"ל sACSF.
2. עטפו גור יום 0 עד 2 (P0-P2) לאחר הלידה באיזה פרפילם או כפפה והניחו אותו מכוסה היטב מתחת לקרח. הגדר טיימר למשך 5 דקות והפעל אותו. לאחר זמן זה, הסר את הגור ובדוק שהוא אינו מגיב לצביטה של הכפה האחורית.
3. ערפו את ראשו של הגור ואספו את הראש בצלחת פטרי מלאה ב-sACSF. חותכים את העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת.
4. אתר את הפתח בגולגולת במוח האחורי / חוט השדרה והכנס קצה אחד של המלקחיים לאורך החלק הגבי של הגולגולת. תפסו בעדינות את הגולגולת בקו האמצע ו'קלפו' חתיכות לרוחב כדי לחשוף את המוח, והיזהרו לא לפגוע במוח.
5. לאחר הסרת החלקים הגביים והצדדיים של הגולגולת, השתמש במלקחיים או במרית כדי להסיר בעדינות את המוח מהגולגולת על ידי גריפה מתחת לפני השטח הגחוני של המוח, תוך ניסיון לא לפגוע באף אזור. הניחו את המוח בצלחת פטרי נוספת מלאה ב-sACSF פחמימתי. הערה: אנו מציגים שתי אסטרטגיות שונות לניתוח ההיפוקמפוס, הסטריאטום וקליפת המוח. האסטרטגיה הראשונה (שלבים 2.1-2.10) שימושית עבור כל קו עכבר, בעוד שהאסטרטגיה השנייה (שלבים 3.1-3.7) תזדקק לעכבר מדווח פלואורסצנטי כדי להפריד בצורה נקייה את הסטריאטום מהגלובוס פלידוס ומבני מוח אחרים. אם סטריאטום אינו רצוי, התעלם מהחלקים הספציפיים לסטריאטום של שתי הטכניקות

2. קציר סטריאטום, היפוקמפוס וקליפת המוח, טכניקה #1

1. הנח את כל המוח על תבנית מטריצת חתך, צד הגחון כלפי מעלה. הנח סכין גילוח אחד דרך החלק הקדמי ביותר של המוח (דרך מערכת הריח הקדמית).
2. הכנס סכין גילוח נוסף ממש אחורי לראשון כדי ליצור פרוסה של 0.5 מ"מ והנח סכין גילוח נוסף אחורי לזה.
3. העבירו את הפרוסות הללו לצלחת פטרי עם sACSF מפחמיץ והניחו את שאר המוח לכלי נפרד עם sACSF. העבירו את הפרוסות הסטריאטליות לטווח חיתוך כדי להמחיש את הסטריאטום. פרוסות אלה צריכות להכיל חלקים גדולים של הסטריאטום הקדמי וחסרות היפוקמפוס. השתמש בטווח ניתוח פלואורסצנטי עם Nkx2.1-Cre^+/-; פרוסות Ai9^+/- כדי להבדיל בין אות tdTomato הסטריאטלי החלש לבין אות tdTomato החזק של הגלובוס פלידוס.
4. עם או בלי פלואורסצנטיות, צבט את הסטריאטום משתי ההמיספרות בכל החלקים והעביר גושי סטריאטום לצינור 50 מ"ל המסומן כראוי עם sACSF, אחסן על קרח.
5. חתכו את המוח לאורך קו האמצע באמצעות מלקחיים או סכין גילוח והניחו את חצי הכדור כך שהמשטח המדיאלי פונה כלפי מעלה.
6. הסר את רקמת המוח הגחונית (תלמוס, גרעיני בסיס וכו') על ידי צביטה של רקמה זו בעזרת מלקחיים. לאחר השלמתו, ההיפוקמפוס (מבנה בצורת נקניק המשתרע על הציר האנטרופוסטריורי לאורך קליפת המוח הגבית) והצד החדר של קליפת המוח צריכים להיות גלויים בבירור.
7. כדי להסיר את ההיפוקמפוס, הכניסו את קצות המלקחיים לפני ההיפוקמפוס הקדמי והפרידו בעדינות את ההיפוקמפוס מקליפת המוח על ידי הזזת המלקחיים לאחור וצביטה לאורך גבול ההיפוקמפוס-קליפת המוח. העבירו את ההיפוקמפוס המבודד לצינור 50 מ"ל המסומן כראוי עם sACSF, אחסן על קרח.
8. כדי לנתח את קליפת המוח, הניחו את הצד המדיאלי של קליפת המוח החצויה כלפי מטה. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לצבוט את החלקים הגביים, הגחוניים, הקדמיים והאחוריים ביותר של קליפת המוח כדי להשאיר נתח מרובע של קליפת המוח הסומטוסנסורית האמצעית, ~2 מ"מ על 2 מ"מ. הפוך את קליפת המוח כך שהצד המדיאלי יהיה כלפי מעלה ונקי מכל עודף רקמה שאינה קליפת המוח (תלמוס, גרעיני בסיס וכו') על פני השטח המדיאלי במידת הצורך. העבירו את נתח קליפת המוח לצינור 50 מ"ל המסומן כראוי עם sACSF, אחסן על קרח.
9. חזור על ההליך עם חצי הכדור השני כדי לאסוף גם את אזורי ההיפוקמפוס וגם את אזורי קליפת המוח.
10. חזור על הליך זה עבור כל הגורים, הקפד להחליף את ה-sACSF בצלחות הפטרי בין גורים כדי להבטיח שה-sACSF יישאר קר ורענן.

3. קציר סטריאטום, היפוקמפוס וקליפת המוח, טכניקה #2

1. הנח את צד הגחון של המוח כלפי מטה בצלחת פטרי מצופה סילגרד המכילה sACSF והצמד אותו כלפי מטה דרך המוח הקטן וקליפת המוח הקדמית או נורות הריח.
2. החל מחצי כדור אחד, השתמש במלקחיים מעוקלים כדי להפריד בעדינות את קליפת המוח האחורית מההיפוקמפוס הבסיסי ורקמות אחרות. הניחו בעדינות את קליפת המוח הקלופה שטוחה על צלחת פטרי. חזור על הפעולה עבור חצי הכדור השני. היפוקמפוס וסטריאטום צריכים להיות נראים בבירור במוח חשוף.
3. השתמש במלקחיים כדי לצבוט היפוקמפוס אחד בקו האמצע ולקלף את ההיפוקמפוס לרוחב כדי להסירו. מניחים בבקבוקון איסוף על קרח וחוזרים על הפעולה עם היפוקמפוס אחר.
4. עבור הסטריאטום, מגרדים בעדינות סביב שולי הסטריאטום כדי לשחרר אותו מהרקמה שמסביב. לאחר מכן, הסירו את הסטריאטום על ידי צביטה מלמטה והוסיפו אותו לצינור האיסוף על קרח. חזור על הפעולה עבור הסטריאטום השני.
5. ניתן לקצור חלקים בקליפת המוח כמתואר בשלב 2.8.
6. אם משתמשים בקו עכבר מדווח טרנסגני (למשל, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP וכו'), מעבירים את הסטריאטום לצלחת פטרי עם sACSF וצופים תחת טווח חיתוך פלואורסצנטי. השתמש במלקחיים כדי להסיר כל רקמה שאינה סטריאטלית מהסטריאטום (ב-Nkx2.1-Cre; עכברי Ai9, הסירו את כל הרקמות ה'בהירות', מכיוון שלגלובוס פלידוס יש בולטות גנגליונית מדיאלית גבוהה בהרבה או נגזרת MGE, צפיפות תאים tdTomato+ בהשוואה לסטריאטום). חזור על הפעולה עבור כל הסטריאטום.
7. חזור על הליך זה עבור כל הגורים, הקפד להחליף את ה-sACSF בצלחות הפטרי בין גורים כדי להבטיח שה-sACSF יישאר קר ורענן.

4. יצירת דיסוציאציות של תא בודד

1. לאחר השלמת הדיסקציה, הכינו תמיסת פרונאז של 1 מ"ג/מ"ל על ידי שקילת 10 מ"ג פרונאז והמסה ב-10 מ"ל sACSF קרמבוקסיטי.
2. העבירו את הרקמה מבקבוקוני האיסוף של 50 מ"ל לצינורות תחתונים עגולים של 5 מ"ל המכילים 2 מ"ל של תמיסת Pronase-sACSF. דגרו את הרקמה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, תוך ניעור/תנועה של הצינור 3-4 פעמים עם האצבע במהלך הדגירה כדי לערבב את הדגימות.
3. במהלך הדגירה הזו, הכינו תמיסת בנייה מחדש: סרום בקר עוברי 1% (FBS, 100 מיקרוליטר) + DNAse (1 מיקרוליטר של 1:10,000 DNA מלאי) ב-10 מ"ל sACSF פחמימצי.
4. לאחר 20 הדקות, הסר בזהירות את תמיסת הפרונאז כדי לא להפריע לרקמה בתחתית והחלף אותה ב-1-2 מ"ל של תמיסת Reconstitution (הנפח הכולל תלוי בכמות ההתחלתית של הרקמה).
5. ניתוק מכני של הרקמה על ידי טריטורציה של הרקמה עם פיפטות פסטר מלוטשות אש שהוכנו קודם לכן. החל מהפיפטה הגדולה (~600 מיקרומטר), שאפו והוציאו את תמיסת הרקמה לפחות עשר פעמים כדי לפרק את הרקמה. אל תכניס בועות לתמיסה. חזור על תהליך זה עבור הפיפטה הבינונית והפיפטה בעלת הקדח הקטן. התמיסה צריכה להיות מעוננת, ולא צריכה להיות פיסת רקמה ברורה בצינורות האיסוף.
6. הכניסו את תמיסת הליזאט של התא דרך מסנן של 50 מיקרומטר לצינורות חרוטיים של 5 מ"ל כדי להסיר גושי תאים. המשך עם פתרונות תאים בודדים אלה לזרימה ציטומטרית (או פוטנציאלית ישירות לספירת תאים אם אין צורך במיון).

5. הכנת תמיסות תאים מטוהרות במיון תאים פלואורסצנטי (FACS) להשתלה

1. עם קבלת תמיסות התאים מציטומטר הזרימה, העבירו את התמיסה לצינור חרוטי אחד (או מרובה) של 1.5 מ"ל וסובבו את התאים ב-500 גרם למשך 5 דקות ב-4^מעלותצלזיוס. לאחר צנטריפוגה, הסר את המדיה כך שיישארו ~20-40 מיקרוליטר בצינור. הרכיבו מחדש תאים במדיה שנותרה (ושלבו תמיסה אם היה צורך במספר צינורות).
2. על פיסה קטנה של פרפילם, מערבבים יחד 2 מיקרוליטר של תמיסת תא + 8 מיקרוליטר sACSF + 10 מיקרוליטר של כתם כחול טריפאן. הכניסו 10 מיקרוליטר לתוך המוציטומטר עם כיסוי שקופיות.
3. ספרו את מספר התאים החיים בכל אחת מהרשתות המרובעות בגודל 4X4 בפינות ההמוציטומטר באמצעות מונה ידני מעבדתי סטנדרטי (תאים מתים יהיו כחולים מהצבע) וממוצע 4 הספירות הללו. הכפל את המספר הזה ב-100 כדי לקבוע את מספר התאים למיקרוליטר.
4. במידת הצורך, התאם את הנפח כך שהתאים יהיו בריכוז של 10,000-30,000 תאים/מיקרוליטר בתמיסת Reconstruct. הריכוז הסופי תלוי בכמות התאים הכוללת ובמספר ההשתלות הרצוי. שמור תאים על קרח להשתלה

6. השתלה לגור P0-2 WT

1. עטפו גור מסוג בר (WT) באיזה פרפילם או כפפה והניחו אותו מכוסה היטב מתחת לקרח. הגדר טיימר למשך 5 דקות והפעל אותו. לאחר זמן זה, הסר את הגור ובדוק שהוא אינו מגיב לצביטה של הכפה האחורית.
2. בזמן שהגור על קרח, ערבבו את תמיסת התא על ידי פיפטינג מספר פעמים כדי להבטיח שתרחיף התאים מעורבב היטב לפני הטעינה (ערבבו את התאים לפני העמסת המיקרופיפטה לכל זריקה). לאחר מכן רוקנו את המיקרופיפטה של השמן המינרלי ומלאו אותה לחלוטין בתרחיף התאים.
3. הניחו את הגור המורדם על צלחת הפטרי כשראשו מונח על המרק הדביק כך שהחלק העליון של הראש יהיה שטוח יחסית. הניחו את הסרט עם חור היהלום על ראשו של הגור, משכו אותו מתוח כדי להבטיח שהעור מתוח והראש יציב אך שהעכבר נוח ונושם היטב. למבדה צריכה להיות גלויה דרך חור היהלום.
4. הזיזו את הגור המאובטח מתחת ל-Nanoject והורידו את המיקרופיפטה כך שקצה המיקרופיפטה יהיה ישירות מעל הלמבדה. רשום את קואורדינטות x-y על המניפולטור.
5. כוונן את כפתורי המניפולטור כדי להזיז את המיקרופיפטה לקואורדינטות הרצויות לאורך הציר המדיולטרלי והאנטרופוסטריורי של הראש: קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית או קליפת המוח S1 → 1.0 מ"מ קדמית ו-1.0 מ"מ לרוחב, היפוקמפוס → 0.75-1.0 מ"מ קדמי ו-1.0-1.2 מ"מ לרוחב, סטריאטום → 2.0-2.2 מ"מ קדמי ו-1.5 מ"מ לרוחב. ניתן לכוונן מעט את הקואורדינטות כדי לפצות על גיל הגור (למשל, P0 לעומת P2) או על זן העכברים (למשל, עכברי CD1 גדולים מ-C57/B6 ב-P2).
6. הורד את המיקרופיפטה עד שהיא יוצרת קעור קטן על העור. לאחר מכן סובב את כפתור המניפולטור של ציר ה-z בחוזקה אך בעדינות כדי להניע את המיקרופיפטה דרך העור והגולגולת כדי להיכנס למוח. כאשר המיקרופיפטה נכנסת למוח, הלחץ על הגולגולת ישתחרר והקיעור ייעלם.
7. משוך מעט את המיקרופיפטה עד שהקצה מוקף בחרוט עור, בצורת אוהל. קרא את הקואורדינטות לאורך צירי z: זו תהיה נקודת האפס של ציר z.
8. הורד את המיקרופיפטה לעומק הרצוי: קליפת המוח → 0.75-1.0 מ"מ, היפוקמפוס → 1.2-1.5 מ"מ, סטריאטום → 2.0-2.5 מ"מ. ניתן לכוונן מעט את העומק כדי לפצות על הגיל או המתח של הגור.
9. הזריק את תרחיף התאים באמצעות תוכנית Nanoject III שתוארה לעיל. לאחר השלמת תוכנית ההזרקה, המתן 15-20 שניות לפני שתמשוך לאט את המיקרופיפטה כדי למזער את דליפת התמיסה מאתר ההזרקה.
10. אם מבצעים זריקות דו-צדדיות, אפס מחדש את המיקרו-פיפטה מעל למבדה ועבור לקואורדינטות המתאימות בחצי הכדור השני. לחלופין, ניתן לבצע שתי זריקות לקליפת המוח של אותה המיספרה על ידי הזזת המיקרופיפטה 1 מ"מ לפני הזריקה הראשונה.
11. לאחר השלמת ההשתלה, הסר את הסרט והעביר את הגור לכרית החימום. במידת הצורך, תייגו את הגור לפי גזירה בזנב או בבוהן. לאחר שהגור רכש מחדש צבע אדום והוא זז, החזירו אותו לכלוב עם האם.

חומרים