טרנספקציה מתווכת אלקטרופורציה של גרעיני שורש הגב של העכבר כדי לקדם התחדשות אקסונים חושיים

תקציר

מקור: Li, Q. et al. חקירת התחדשות אקסונים של יונקים: אלקטרופורציה in vivo של גנגליון שורש גב של עכבר בוגר. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים טרנספקציה בתיווך אלקטרופורציה של נוירוני DRG של עכברים כדי לחקור התחדשות אקסונים. הוא מתאר את השלבים להעברת מבני חומצות גרעין לנוירונים DRG, גרימת פגיעה בעצב הסיאטי והערכת התחדשות אקסונלית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. גנגליון שורש הגב (DRG) Injection
   1. להזריק תמיסת הרדמה (לדלל את האוורטין במי מלח סטריליים בריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל, עם אברטין 200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תוך צפקית כדי לשמור על ההרדמה לפני הזרקת DRG.
   2. טען את הפלסמידים של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) או אוליגוס חומצה ריבונוקלאית (RNA) (1 מיקרוליטר לכל DRG) לתוך פיפטת נימי הזכוכית.
   3. הכנס את קצה פיפטת הזכוכית הנימים בזהירות לתוך ה-DRG.
   4. הזרקו בהדרגה תמיסה של 1.0 מיקרוליטר של פלסמידים DNA או אוליגוס RNA לתוך ה-DRG באמצעות מערכות חלוקת המיקרו-הזרקה תוך תאיות (30 psi, 8 ms).
      הערה: משך ההזרקה צריך להימשך לא פחות מ-5 דקות.
2. Electroporation
   1. זרוק מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) על קצות האלקטרודות.
   2. נקו את הדימום בעזרת גזה כותנה מרובעת מעוקרת.
   3. צבט את DRG המטרה עם האלקטרודות בעדינות והחל 5 פולסים חשמליים מרובעים עם מערכת האלקטרופורציה.
   4. סגור את שכבות השריר והעור עם 5-0 תפרי ניילון, בהתאמה.
   5. הנח את העכבר על שמיכה מחוממת (35.0 מעלות צלזיוס) בתשומת לב רבה עד שהוא חזר לחלוטין להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה החזר את העכבר לכלוב הביתי לאחר שהתאושש לחלוטין מההרדמה.
      הערה: לוקח לעכבר כ-60 דקות להתאושש לחלוטין מההרדמה על שמיכת 37 מעלות צלזיוס. יש להמיס כדור אחד (200 מ"ג) איבופרופן ב-1,000 מ"ל מים (0.2 מ"ג/מ"ל) להאכלה יומית כדי להקל על הכאב שלאחר הניתוח.
3. Sciatic Nerve Crush
   1. יומיים או שלושה (תלוי בתכנון הניסוי) לאחר האלקטרופורציה של DRG, יש להרדים את העכבר תוך צפקי עם תמיסת ההרדמה (עם אברטין 400 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
   2. הדביקו את ארבע גפיו של העכבר על לוח השעם.
   3. בצע חתך של 1 ס"מ 0.5 ס"מ לצד שמאל לאורך קו האמצע. חותכים את השרירים, כמו שריר הגלוטאוס מקסימוס ושריר הפיריפורמיס, לאורך. חשוף את קטע העצב הסיאטי בין הנקב הסיאטי הגדול יותר לחריץ הסיאטי.
   4. מועכים את העצב בעזרת מלקחיים מיקרו-כירורגיים למשך 12 שניות וסמנו את מקום הריסוק בתפר אפינוירולי ניילון 10-0. צור קשר על הממברנה הדוראלית כדי לסמן את אתר הריסוק.
   5. סגור את שכבות השריר והעור עם תפר ניילון 5-0.
   6. הנח את העכבר על שמיכה מחוממת (35.0 מעלות צלזיוס) בתשומת לב רבה עד שהוא חזר לחלוטין להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה החזר את העכבר לכלוב הביתי לאחר שהתאושש לחלוטין מההרדמה.
      הערה: לוקח לעכבר כ-60 דקות להתאושש לחלוטין מההרדמה על שמיכת 37 מעלות צלזיוס. יש להמיס כדור אחד (200 מ"ג) איבופרופן ב-1,000 מ"ל מים (0.2 מ"ג/מ"ל) להאכלה יומית כדי להקל על הכאב שלאחר הניתוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ECM 830 מערכת אלקטרופורציה גל מרובע	BTX הרווארד מנגנון	45-0052	עבור אלקטרופורציה in vivo
אלקטרודות פינצטה BTX	הרווארד מכשיר	45-0524	עבור אלקטרופורציה in vivo, 1 מ"מ שטוח
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	מערכות חלוקת מיקרו-הזרקה תוך תאית
נימי זכוכית בורוסיליקט	World Precision Instruments, Inc.
1902328 מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו	Leica	M80
מיקרו-כירורגיה מלקחיים	FST מאת DUMONT, שוויץ	11255-20	רק לריסוק עצב סיאטי
זכוכית נימי	עולם Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 ס"מ, סרט קיר סטנדרטי
	Fisherbrand	15-901-30	לקיבוע העכבר על לוח השעם
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	תמיסת מלאי Avertin
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock
solution siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	siRNA שאינו מטרה עם מיקרו-RNA פלואורסצנטי
בקרת טרנספיקציה חיקוי עם Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	מיקרו-RNA לא יעד עם ערכת הכנת פלסמידים פלואורסצנטיים
	Invitrogen Purelink	K210016	הכנת פלסמיד מקודד GFP
צבע ירוק מהיר	Millipore-Sigma	F7252	להדמיה טובה יותר של מתאר ה-DRG במהלך ההזרקה
קטמין	פוטני, בע"מ	NDC 26637-731-51	אינדוקציה הרדמה
קסילזין	AnaSed	NDC 59399-110-20	אינדוקציה בהרדמה
אצטמינופן	מקניל Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	שיכוך כאבים לאחר ניתוח