העברה תוך-תקלית של וירוסים במודל עכבר לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית

תקציר

מקור: Li, D., et al. הזרקה תוך-תקלית ישירה של נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הליך ההזרקה התוך-תקלית של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV) לנוזל המוח (CSF) של עכבר ער, המכסה הכנת מזרק, יישור עמוד השדרה והחדרת מחט מדויקת. שיטה זו מאמתת העברת גנים ממוקדת, ותומכת בפוטנציאל שלה לטיפולים במערכת העצבים המרכזית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת תמיסת מלאי 20% לידוקאין הידרוכלוריד

1. שוקלים 2 גרם לידוקאין הידרוכלוריד. מוסיפים 5-6 מ"ל מים סטריליים ומערבולת בעדינות. הגדל את הנפח ל -10 מ"ל עם מים סטריליים.
2. 1.2 סנן את תמיסת המלאי דרך מסננים של 0.2 מיקרון. בחר את תמיסת המלאי, 1 מ"ל לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ואטום אותו בסרט איטום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. משלוח AAV תוך-תקלי ישיר בעכברים ערים

1. נגב את אזור העבודה באמצעות גזה סטרילית עם 70% אתנול והכן את האספקה הנדרשת.
2. הכן 100 מיקרוליטר של קומפלקס AAVrh.10/1% לידוקאין הידרוכלוריד על ידי הוספת 95 מיקרוליטר של תמיסת מלאי rAAVrh10 (5 x^{10 12} עותקי גנום/מ"ל) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 200 מיקרוליטר מיקרו-צנטריפוגה, והוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי לידוקאין הידרוכלוריד 20%. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, אחסן את תמיסת הנגיף על קרח (4 מעלות צלזיוס).
   הערה: ייעשה שימוש ב-8 מיקרוליטר לעכבר.
3. הכנת המזרק עם תמיסת AAV להזרקה
   1. הרכיבו מזרק המילטון 25 מיקרוליטר עם מחט 27 גרם ויישר את הקצה המשופע של המחט עם הסולם הנפחי על המזרק.
   2. שאב בעדינות 8 מיקרוליטר עם 4 x^{10 10} עותקי גנום של תמיסת הנגיף לתוך המזרק. הקפד להסיר בועות אוויר.
4. הכנת העכבר
   הערה: מחקר זה השתמש בעכברי FVB/NJ זכרים או נקבות (בני 30-70 יום). הזרקת IT בוצעה במכסה המנוע.
   1. עקר את אזור העבודה במכסה מנוע עם 70% אתנול. הניחו את העכבר הער (זכר או נקבה, בן 30-70 יום, משקל 13-20 גרם) על מיטה במצב נוטה במכסה המנוע. כסו את פלג הגוף העליון בגזה סטרילית כדי להרגיע את העכבר ולהימנע מנשיכה.
   2. תקן את החיה על ידי אחיזה נכונה ויציבה בחגורת האגן שלה עם אגודל בצד אחד ואצבע/אצבע אמצעית בצד השני. שמור על העור בין חגורות האגן הדו-צדדיות מתוח עם האגודל והאצבע. החזק בעדינות את פלג הגוף העליון של החיה עם כף היד.
   3. גלחו את הפרווה על הגב בין חגורות האגן הדו-צדדיות, ולאחר מכן עקרו את פני העור בעזרת פילינג על בסיס יוד ואתנול 70%.
5. הזרקה תוך-תקלית
   1. הרגישו את החלל הבין חולייתי לאורך הקו האמצעי בין חגורות האגן הדו-צדדיות עם אגודל או אצבע של היד השנייה ולחצו על שקע עם ציפורן כדי לציין את החלל הבין חולייתי L5-L6 (אתר את אתר ההזרקה).
   2. סובב מעט ובעדינות את בסיס הזנב כדי לציין את קו האמצע של עמוד השדרה. כוונן את שיפוע המחט לכיוון ראש החיה לפני ההזרקה.
   3. ודא שבעלי החיים מקובעים היטב, ויישר את המחט לאורך קו האמצע של עמוד השדרה.
   4. הכנס את המחט בעדינות ואנכית (או הטה מעט 70-80°) בצומת השקע, תוך שמירה על המזרק במישור סגיטלי מרכזי. צמצם לאט את הזווית לכ-30 מעלות כאשר היא מחברת את העצם, ואז החלק את המחט לתוך החלל הבין חולייתי.
      הערה: תנועת זנב פתאומית ניכרת היא סימן לכניסה מוצלחת לחלל התוך-דוראלי. ברגע שהמחט נכנסת לחלל הבין חולייתי, קצה המחט ירגיש מהודק היטב. מחט ה-27 G ששימשה במחקר זה מתאימה להעברת IT בעכברים אך לא בחולדות.
   5. הזרקו את תמיסת הווקטור. הפעל את הטיימר והזריק 8 μL של תמיסת הווקטור במהירות של 1 μL/4 s. שמור את המחט כדקה אחת לאחר סיום הלידה. משוך את המחט בסיבוב עדין כדי למנוע דליפה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברי FVB/NJ	מעבדות צ'ארלס ריבר סין
לידוקאין הידרוכלוריד מונוהידראט	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core של המרכז לטיפול גנטי באוניברסיטת בית הספר
25μL מזרק המילטון/מחט 27-30 גרם	GASTIGHT	1702
70% אתנול	WEN ZHI
גזה	Wei AN	5171112	8 ס"מ * 10 ס"מ * 12 ס"מ

לרפואה של מסצ'וסטס