הזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט הרשתית במודל עכבר

תקציר

מקור: Park, S. W., et al. גישה לימבלית - הזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לטיפול גנטי באפיתל פיגמנט רשתית של עכברים. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון מתאר את השיטה להזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) במודל עכבר. הוא מפרט את ההליך מהרדמה והכנת עיניים ועד לאספקה מדויקת של וקטור לנטי-ויראלי, מה שמבטיח אינטגרציה וביטוי גנים ב-RPE.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת ערכת הזרקה ווקטורים ויראליים

1. הכן את מזרק המיקרוליטר המצויד במחט קהה 33 גרם מעוקרת באמצעות גז אתילן אוקסיד. לדלל את הווקטורים הוויראליים ב-PBS (Phosphate buffered Saline) לקבלת טיטר הולם במיקרו-צינור (כלומר, 1 x 10⁶ TU/μl). שטפו את המזרק מספר פעמים עם וקטורים ויראליים כדי להסיר שטח מת במזרק.

2. הזרקה תת-רשתית של וקטורים ויראליים

1. יש להרדים את העכברים הבוגרים (כלומר, בני 6-8 שבועות) באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת של טילטמין וזולאזפאם (1:1, 2.25 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין הידרוכלוריד (0.7 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או משטר הרדמה חלופי מתאים.
2. הרחבת אישונים עם טיפת עין של פנילפרין 0.5% וטרופיקמיד 0.5%.
3. הכן את מזרק המיקרוליטר על ידי העמסתו עם 1.5 - 2 מיקרוליטר של וקטורים ויראליים.
4. פתחו את העפעף והבליטו את העין כדי לחשוף את קו המשווה להזרקה נוחה. התמקד בו תחת מיקרוסקופ ההפעלה. שמרו על תנוחת העין הבולטת עד לסיום ההזרקה, אחרת תזוזה של המחט יכולה להתרחש במהלך ההזרקה. כדי להחזיק את גלגל העין בחוזקה, הנח את האצבעות מחוץ לשפת המסלול.
5. מרחו טיפה של תמיסה ויסקו-אלסטית עיניים על פני הקרנית.
6. הניחו שקופית כיסוי עגולה קטנה על החלק העליון של הקרנית כדי לדמיין את הרשתית.
7. נקב חור קטן בחלק האחורי הקל של הלימבוס באמצעות מחט סטרילית של 30 גרם 1/2 להזרקה תת-רשתית נוספת. מטעמי נוחות, הפוך את החור לנחות בעין ימין ועדיף בעין שמאל.
   הערה: אם החור נוצר בחלק הזמני או באף, קשה לכסות אותו על ידי העפעף לאחר ההזרקה. יש לבצע את הניקוב הראשוני מעט אחורי ללימבוס כדי להימנע מכלי הדם הלימביים העוברים לאורך הלימבוס וניתן לזהות אותם בקלות. היזהר להימנע מפגיעה בעדשה עם מחט בזמן ביצוע הפנצ'ר הראשוני. אל תכניס את כל השיפוע של המחט כדי למנוע ניקוב בעדשה.
8. הנח את המחט הקהה 33 G של מזרק המיקרוליטר דרך החור המנוקב מראש והתקרב למחט לתוך החלל התת-רשתית עד שתורגש התנגדות קלה.
   הערה: עבור ההזרקה התת-רשתית, זווית הגישה הטובה ביותר של המחט היא כ-45 מעלות כנגד מישור הקשתית, ויש לדחוף את המחט הקהה לאחור לכיוון האזור ההיקפי. הריבוע המקווקו מציין את מסלול המחט המוצע על פני חלל הזגוגית להזרקה תת-רשתית באיור 1.
   הערה: לא תורגש התנגדות בעת פירסינג (או מעבר) שכבות הרשתית מכיוון שהן רכות מאוד. לפיכך, התחושה הראשונה של התנגדות קלה מצביעה על כך שהמחט כבר נגעה בשכבת RPE (אפיתל פיגמנט רשתית), ויש להפסיק את החדרת המחט. היזהר לא לחדור לרקמת הסקלר בלחץ מוגזם מכיוון שיש למקם את המחט בחלל התת-רשתית הפוטנציאלי. אם המחט מנקבת את רקמת הסקלר בכוח מופרז, היא נכנסת לחללי המסלול החוץ-עיני ללא התנגדות. (שלב זה הוא קריטי)
9. הזרקו את הווקטורים הוויראליים (למשל, 1 x 10⁶ TU/μl) בעדינות לתוך החלל התת-רשתית ללא רעד כדי למנוע נזק לא רצוי לרקמות. לאחר מכן, משוך את המחט בעדינות. החזק את גלגל העין בחוזקה במהלך ההזרקה, כמתואר בסעיף 2.4.
10. התבונן בהיווצרות כתמים תת-רשתית לאחר ההזרקה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שאין דימום ברשתית.

תוצאות

איור 1. תרשים סכמטי של ההזרקה התת-רשתית. H&E (צביעת המטוקסילין ואאוזין) חתך מוכתם של עין העכבר המתאר את המבנים עם מסלול מחט להזרקה תת-רשתית המסומן (ריבוע מנוקד). הגדלה: 40X, סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פינצטה DUMONT #5 11 ס"מ DUMOSTAR 0.1 x 0.06 מ"מ טיפים	WPI	500233
VANNAS מספריים S/S, 105 מ"מ	WPI	555583S
33G מחט קהה	WPI	NF33BL-2
מזרק NanoFil, 10 מיקרוליטר	WPI	NANOFIL
RPE-KIT	WPI	RPE-KIT	להזרקה קלה ביד אחת
30Gx1/2 (0.3 מ"מ x 13 מ"מ) BD PrecisionGlideTM מחט	BD		305107 ניקוב ראשוני להזרקה תת-רשתית
מיקרוסקופ כיסוי משקפיים (מס' 1 קוטר 3 מ"מ)	Warner Instruments	64-0720 (CS-3R)
Leica הפעלה מיקרוסקופ	Leica	LM M80
מיקרוסקופ פלואורסצאין	Nikon	Eclipse 80i
Lentivirus	Thermo Scientific	TMO. LV-Ctr	משמש לדילול וקטורים
PBS	Gibco	10010-015	משמש לדילול וקטורים
טרופרין (פנילפרין 0.5%-טרופיקמיד 0.5%)	Hanmi		להרחבה
תמיסת עיניים פרופרקאין הידרוכלוריד USP, 0.5% (סטרילי)	Bausch&Lomb		להרדמה מקומית
Healon GV OVD	Abbott Medical Optics Inc.
זולטיל 50 (טילטמין היפוכלוריד וזולזפאם היפוכלוריד)	Virbac		להרדמה כללית
הזרקת רומפון® (קסילזין הידרוכלוריד)	באייר		להרדמה

כללית