מיקרו-הזרקת מוח מכרסם באמצעות מיקרו-מחט קוורץ

תקציר

מקור: Paolone, G., et al. מחטים מותאמות אישית למיקרו-הזרקות במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים הזרקת מיקרו-מחט למוח מכרסמים באמצעות מיקרו-מחט קוורץ עם חורים. המיקרו-מחט מחוברת למזרק ולמיקרו-משאבה כדי לשלוט בקצב האספקה. המחט עם תמיסת ההזרקה מוחדרת למוח כאשר מהירות האספקה מוגדרת נמוכה. לאחר המיקום, מהירות האספקה מוגברת. המחט נשלפת לאחר הפסקה קצרה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת מחטי קוורץ

1. נקו ועקרו את נימי הקוורץ (ראה טבלת חומרים) על ידי הנחתם למשך 5 דקות במים מזוקקים, 5 דקות באתנול 99% ו-5 דקות בדיאתיל-אתר.
2. השאירו נימים מתחת למכסה המנוע למשך שעה אחת לפחות כדי לתת להם להתייבש לחלוטין.
3. הכן את המחטים באמצעות מושך לייזר על פי פרמטרים המאפשרים ייצור מחט ארוכה ודקה מספיק, בהתאם לצרכים האישיים.
   הערה: אנו משתמשים במושך לייזר (ראה טבלת חומרים). השתמש בתוכנית בת שתי שורות למשיכה. הקו הראשון משתמש בהספק גבוה, באורך הסריקה הגדול ביותר (המתאים לערך של נימה), וללא כוח משיכה. שילוב פרמטרים זה מוביל להתכה של החלק הגדול ביותר של הנימים במהירות ההארכה הנמוכה ביותר, מה שמאפשר עיצוב של מחט ארוכה בגודל פנימי/חיצוני גדול ושוק מופחת. באופן זה, המחט שומרת על עמידות מכנית גבוהה וקוטר פנימי רחב המאפשר מעבר של תאי גזע או חלקיקים נגיפיים ללא סתימה. המהירות והעיכוב של קו תוכנית זה אמורים לעצור את הארכת הנימים לפני שהקצה הופך קטן וארוך מדי, ומפספס את המאפיינים המכניים והצורה הנדרשים. הקו השני של תוכנית המשיכה מבוצע אוטומטית ברגע שהקוורץ מתקרר (5 שניות). פרמטרים של כוח, נימה וכוח משיכה פונקציונליים לחיתוך קצה עם אורך הקצה הקצר ביותר האפשרי ושוק תלול, הימנעות מהפרדת שתי המחטים עם קרע בקצה. באופן שגרתי, עם הציוד שלנו, אנו משתמשים בדברים הבאים: (א) קו 1 = הספק 990, נימה 5, מהירות 130, עיכוב 110, משיכה 0; (ב) קו 2 = הספק 970, נימה 3, מהירות 0, עיכוב 70, משיכה 0.
4. הכניסו את המחטים לצלחת פטרי שנוקה בעבר עם 70% אתנול.
   1. מכסים את המנה בסרט פרפין מפלסטיק.
5. חותכים את הנימים בעזרת המיקרו-דיסקטור.
   1. בעת ההפעלה, תן ללייזר להריץ תהליך כיול אוטומטי כדי לאמת את הכוח והאנרגיה המועברים. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי החיתוך.
      הערה: אנו משתמשים במיקרו-דיסקטור (ראה טבלת חומרים) ובפרמטרים הבאים: אנרגיית דופק כוח לייזר (63 μJ), קוטר קרן לייזר של 20% מהצמצם המרבי (צמצם מקסימלי: 1.0 מיקרומטר), ומהירות חיתוך של 10% מהמהירות המקסימלית (מהירות מקסימלית: 30 מיקרומטר לשנייה).
   2. קבע היטב את המחט על שולחן המיקרוסקופ ומקם את קצהו במרכז מסך המחשב.
   3. בשורת התפריטים, לחץ על סמל העיפרון והשתמש בו כדי לצייר סימן לחיתוך לייזר של המחט.
      הערה: החיתוך צריך להיות בזווית של כ-45° ביחס למשטח המחט.
   4. בפונקציית סרגל הצד, בחר את הדגל המכיל את כפתור "START CUT" כדי לאפשר ללייזר לחתוך את הנקודה שסומנה קודם לכן.
   5. במידת הצורך, חתכו חורים צדדיים על ידי חזרה על ההליכים המתוארים ב-1.5.2-3; אין צורך למקם מחדש את המחט (איור 1).
6. ניקוי לאחר חיתוך.
   1. חבר את המחט למשאבה ריקה דרך צינור פלסטיק.
   2. הפעל את המשאבה והגדר ידנית את קצב הזרימה קדימה במהירות מתונה (3 מיקרוליטר לדקה).
   3. שאפו תחילה את 99% האתנול ולאחר מכן את המים המזוקקים כדי להסיר זיהומים עקב חיתוך.
   4. שאפו שוב את האתנול 99% כדי להקל על הייבוש.
      הערה: כל שלב צריך להימשך לפחות 3 דקות.
7. אחסן את המחטים בצלחת פטרי מכוסה כהלכה עד ליום הניתוח.
8. ניתן לעשות שימוש חוזר במחטים; בסוף הניסוי יש לנקות עם אקונומיקה ואתנול כדי להסיר את התמיסה ושאריות רקמות אפשריות. לניקוי מלא יותר, הכניסו את המחטים לצנצנת אחסון מיקרופיפטה כשהקצה פונה כלפי מטה, מלאו את הצנצנת במים מזוקקים עד לכיסוי הקצוות, הרתיחו במשך 1.5 דקות כדי להסיר שאריות רקמה, ולאחר מכן שטפו עם אתנול.

2. נוהל

1. בהתאם להוראות המסופקות במדריך למשתמש של המשאבה, בחר בתפריט ההגדרות כדי לכייל את המשאבה בהתאם לקוטר/נפח של מזרק המיקרו-הזרקה והגדר את קצב הזרימה על 0.3 מיקרוליטר לדקה.
2. מלאו מזרק של 10 מ"ל המצויד במחט קהה (למשל, מחט המילטון, 30 גרם) וצינור פוליטטרפלואורואתילן קצר במים סטריליים והשתמשו בו למילוי מזרק המיקרו-הזרקה (לאחר הסרת הבוכנה בזהירות רבה) וערכת מכלול חלקי ההזרקה עבור משאבת המיקרו-הזרקה הידנית (MMP).
   הערה: ערכת ה-MMP משמשת להרכבה מאובטחת של המחט במסגרת הסטריאוטקטית (איור 2). הערכה כוללת צינורות פוליטטרפלואורואתילן, מצמד לור-לצינורות, מחזיק פיפטות ואטמים לפיפטות בקטרים חיצוניים שונים.
3. חבר את המחט לערכת MMP.
   1. שטוף יותר מים על פני המערכת דרך מזרק 10 מ"ל, ובדוק אם המים יוצאים מהמחט.
      הערה: הקפד להסיר בועות אוויר בתוך המערכת על ידי חזרה על שלבי המילוי.
4. נתק את מזרק ה-10 מ"ל ממזרק המיקרו-הזרקה תוך דחיפה איטית של הבוכנה על מנת להשאיר טיפת מים בחלק העליון של מזרק המיקרו-הזרקה. הכנס את הבוכנה למזרק המיקרו-הזרקה.
5. חבר את מזרק המיקרו-הזרקה למשאבה והגדר את קצב הזרימה על 0.3 μL/min.
   הערה: המתן עד שתהיה טיפה דולפת מקצה המחט, ולאחר מכן שחרר אותה למשך 3 דקות נוספות.
6. הגדר את הזרימה על 0.1 מיקרוליטר לדקה והתחל בהליך הניתוח. המשאבה אמורה לפעול בזמן ביצוע הניתוח.
   הערה: עבור הניסויים המדווחים במאמר זה, אנו משתמשים בחולדות Sprague Dawley זכרות במשקל 300 גרם (גיל 3 חודשים). עם זאת, ההליך חל על מינים אחרים, במיוחד עכברים.
7. לגרום להרדמה כללית בשיטה המאושרת על ידי התקנות המקומיות.
   הערה: אנו משתמשים בתערובת של הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של 85 מ"ג/ק"ג קטמין ו-8 מ"ג/ק"ג קסילזין למשך 20-50 דקות של הרדמה. חשוב להשתמש בצביטות זנב ו/או בהונות כדי להבטיח שהחיה מורדמת לחלוטין. רמת ההרדמה והמדדים החיוניים הבסיסיים מוערכים לפני תחילת הניתוח ומנוטרים כל 10 דקות בזמן ביצוע הניתוח. טמפרטורת גוף בעלי החיים נשמרת קבועה לפני, במהלך ואחרי הליכים כירורגיים באמצעות כרית חימום המחזירה מים למחזור המים. בעלי חיים מנוטרים עד להחלמה מלאה (למשל, הם זקופים ואמבולטוריים). בנוסף, בעלי חיים מקבלים משככי כאבים (טרמדול, 5-7 מ"ג/ק"ג i.p) לאחר הניתוח כל 24 שעות במשך שלושה ימים.
   1. לגלח את ראש החיה ולהכין כראוי את אתר הניתוח לניתוח אספטי. בצעו קרצוף דו-שלבי עם תמיסה על בסיס יוד (בטאדין) ואחריה 70% אתנול. יתר על כן, כדי לשמור על אספסיס, עטפו את מקום הניתוח בווילון כירורגי (הסרטון הושמט למטרות הדגמה).
8. מקם את החולדה במסגרת הסטריאוטקסית מעל שמיכת חימום המסתובבת מחדש במים. כדי לספק הקלה נוספת בכאב, במקום הניתוח, יש למרוח תמיסת לידוקאין 0.5% (לא לחרוג מ-7 מ"ג/ק"ג). יש לעקר מראש את כל המכשירים הכירורגיים באמצעות מעקר חרוזים או חיטוי נוזלי בקור על ידי טבילת הציוד ב-2% גלוטראלדהיד בתוספת 7.05% פנול (ספורודיצין או סידקס), ולאחר מכן שטיפה במים סטריליים או במי מלח. יש לבצע את החיטוי גם בין ההליכים. בצע חתך אורכי מעל הגולגולת באמצעות אזמל מעוקר. היו עדינים כדי למנוע דימום מוגזם. פתחו את הקרקפת באמצעות מרית שטוחה והניחו קליפסים כירורגיים על דשי העור כדי להשאיר אותה פתוחה. בעדינות רבה, נתק את הפריאוסטאום כדי לחשוף את הברגמה ואת אזור הגולגולת שדרכו תוכנס המחט.
9. הרכיבו את הזרוע על המסגרת הסטריאוטקסית (בזמן שהזרימה נמשכת) והזיזו את קצה המחט בדיוק על גבי ברגמה, שימו לב לא לשבור את קצה. הוסף הערות לקואורדינטות הקדמיות-אחוריות והבינוניות-צדדיות של הברגמה ותרגם לקואורדינטות הרצויות. בהנחיית סטריאומיקרוסקופ, הורד את המחט עד שקצהה כמעט נוגע בגולגולת, סמן את נקודת הקידוח לאחר הרמת מעט הזרוע הסטריאוטקסית.
10. קדחו (קצה מקדחה Ø: 0.8 מ"מ; מהירות מקדחה: 1,000 סל"ד) את הגולגולת במקום המסומן. יש להקפיד לא לחדור לדורה במהלך הליכי הקידוח. במהלך הקידוח יש לטפטף מי מלח סטריליים כדי למנוע נזק לעצמות ונמק.
11. חותכים חתיכה קטנה של סרט פרפין מפלסטיק ומניחים אותה על הגולגולת. בעזרת פיפט 10 מיקרוליטר יוצרים טיפה מהתמיסה להזרקה על סרט הפרפין מפלסטיק. עצור את המשאבה, שלף מעט את דוחף המשאבה וצור בועת אוויר קטנה בנימים על ידי משיכה עדינה של הבוכנה של מזרק המיקרו-הזרקה.
12. הורד את הזרוע הסטריאוטקטית עד שקצה המחט יגיע לטיפה. צייר את הדגימה על ידי משיכה (לאט מאוד) של הבוכנה של מזרק המיקרו-הזרקה, הימנעות מכל היווצרות בועה. החלף את דוחף המשאבה במגע עם הבוכנה והפעל את המשאבה בקצב זרימה של 0.3 מיקרוליטר לדקה. המתן להיווצרות טיפה (מספר דקות) לפני שתמשיך לשלב הבא.
    הערה: בניסוי לדוגמה הנוכחי, נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) הוחדר לסטריאטום [AP (Anteroposterior): +1.5, ML (מדיולטרלי): ±2.7; DV (דורסובנטרלי): -5.0] ובהיפוקמפוס הגבי (AP: -3.5, ML: ±2.1; DV: -3.5; במ"מ מדורה), 2 מיקרוליטר לאתר. כדי להקל על ההשוואה בין שתי שיטות ההזרקה, כל אזור במוח הוזרק באמצעות מחט קוורץ בהמיספרה אחת וקצה קהה של 26 גרם או מחט נירוסטה עם קצה משופע של 30 גרם בשנייה.
13. הורד את הזרימה ל-0.1 מיקרוליטר לדקה, חתך את הדורה עם מחט קצה משופעת מנירוסטה והורד לאט לאט את הזרוע הסטריאוטקטית על הגרזן הגב-גחוני, ונכנס לרקמת המוח. כאשר מגיעים למיקום הרצוי, רדו 0.1 מ"מ נוספים, עצרו את המשאבה, הרימו את הזרוע הסטריאוטקטית ב-0.1 מ"מ והפעל שוב את המשאבה בזרימה ל-0.3 מיקרוליטר/דקה.
    הערה: הסיבה לשמירה על זרימה איטית בזמן הורדת המחט היא להבטיח לחץ חיובי המונע חדירה של שברי רקמה קטנים למחט עצמה. אירוע כזה יחסום את הקצה, ויפגע באספקת התמיסה. מכיוון שקצב הזרימה איטי מאוד בזמן הורדת המחט ומהירות ההורדה היא כ-10 שניות/מ"מ, משמעות הדבר היא שכמויות התמיסה שנותרו לאורך מסלול המחט זניחות בהשוואה לאלו המוזרקות באתר היעד. ניתן להימנע מאמצעי זהירות זה בעת שימוש במחטים עם חורים צדדיים.
14. הפעל את הטיימר והמתן את הזמן הדרוש בהתאם לנפח הרצוי להזרקה (למשלample, 6 דקות 40 שניות אם מזריקים 2 μL). עקוב אחר תנועת הבועות בזמן ההזרקה. בסוף, עצרו את המשאבה והמתינו 5 דקות לפני שתחזירו לאט את המחט. כאשר מחט הקוורץ נשלפת לחלוטין, הפעל שוב את המשאבה ובדוק אם נוצרת טיפה בקצה המחט.
15. יש לאטום את הפתח במשטח הגולגולת בשעוות עצם, להסיר את התפסים ההמוסטטיים ולתפור את הקרקפת, לצפות את האזור סביב הפצע בקרם אנטיביוטי (למשל, ניאוספורין) ולהחזיר את בעל החיים לכלוב הביתי.

תוצאות

איור 1: תמונה מיקרוסקופית של קצה מחט קוורץ, המציגה קטרים שונים של הקצה והחורים המשמשים להזרקת נוזלים. תמונת הגדלה נמוכה ב-(A) והגדלה גבוהה יותר ב-(B) ו-(C). ניתן להכין את המחט באופנים שונים (אורכים שונים, מספרי חורים ומידות חורים שונים) בהתאם ...

חומרים