אספקת siRNA ממוקדת לתאי עצב להשתקת חלבון פריון באמצעות קומפלקסים ליפוזומליים

תקציר

מקור: Bender, H. R., et.al. אספקת siRNA טיפולי למערכת העצבים המרכזית באמצעות ליפוזומים קטיוניים ואניונים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את האספקה הממוקדת של siRNA של חלבון פריון (PrP) לנוירונים באמצעות קומפלקסים ליפוזומליים של siRNA-פפטיד (LSPCs). ליפוזומים קטיוניים קושרים אלקטרוסטטית siRNA מכוון PrP, אשר מיוצב עוד יותר על ידי פפטיד RVG-9r להובלה מתווכת קולטנים על פני מחסום הדם-מוח. ברגע שהם נכנסים למוח, LSPCs עוברים אנדוציטוזיס בנוירונים, משחררים siRNA כדי ליזום הפרעות RNA, מפחיתים את ביטוי ה-PrP ומפריעים להתקדמות מחלת הפריונים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת LSPCs

1. השתמש ב-DOTAP 1:1 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane): יחס כולסטרול עבור LSPCs. להכנת ליפוזום של 4 ננומול, מערבבים 2 ננומול של DOTAP ו -2 ננומול של כולסטרול ל -10 מ"ל של תמיסת כלורופורם: מתנול 1: 1 בבקבוק.
2. לאדות 9 מ"ל מתמיסת הכלורופורם: מתנול באמצעות גז N₂ במכסה אדים. אידוי 1 מ"ל הממס האחרון במכסה אדים למשך הלילה ללא גז. שימו לב לסרט שומנים דק בתחתית הבקבוק.
3. מחממים 10 מ"ל מתמיסת סוכרוז של 10% ל-55 מעלות צלזיוס.
4. יוצקים את תמיסת הסוכרוז המחוממת 10% על שכבת השומן הדקה לאט, כלומר 1 מ"ל לדקה, תוך כדי סיבוב עדין של הבקבוק. שמור על 10% סוכרוז ובקבוק עם שומנים ב-55 מעלות צלזיוס כך שמולקולות השומנים יישארו בשלב הג'ל-נוזל. החזרת נוזלים גורמת להיווצרות שלפוחית רב-שכמתית (MLV).
5. אפשר לליפידים להתייבש בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני גודל הליפוזומים.
6. הרכיבו מכבש לפי הוראות היצרן עם מסנני 1.0 מיקרומטר או השתמשו במסנני מזרק של 1.0 מיקרומטר לגודל.
7. הוסף 1 מ"ל מתרחיף הליפוזום המחומם לאחד המזרקים במכבש והעביר את המתלה בין שני המזרקים 11 פעמים. ודא שהמתלה נמצא במזרק הנגדי ממזרק ההתחלה לאחר 11 המעברים.
8. גודל את הליפוזומים שוב דרך 0.45 מיקרומטר ואז מסננים של 0.2 מיקרומטר כדי ליצור שלפוחיות חד-כיווניות גדולות (LUVs). שמור על תרחיף הליפוזום מחומם לגודל קל יותר.
9. דגרו 20 מיקרוליטר של תרחיף ליפוזום 4 ננומול (200 מיקרומטר) עם 200 מיקרוליטר של תמיסת siRNA מלאי של 20 מיקרומטר (סה"כ 4 ננומול) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
10. דגירה של 80 מיקרוליטר של תמיסת RVG-9r של 500 מיקרומטר (סה"כ 40 ננומול) עם תמיסת siRNA/ליפוזום למשך 10 דקות ב-RT. יש להשתמש ב-LSPCs בהקדם האפשרי אך ניתן להשתמש בהם עד מספר שעות לאחר ההכנה. אחסן LSPCs בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות לאחר ההכנה.

2. הזרקת עכברים עם LSPCs

1. חשוף עכברים למשך 5-10 דקות למנורת חום כדי להרחיב את כלי הדם.
2. להרדים את העכבר בזרימת איזופלואורן/חמצן של 2-3% 5-10 דקות לפני ההזרקה, ובמהלך ההזרקה. אשר את ההרדמה כאשר החיה כבר לא אמבולנטית, והנשימה האטה, על ידי צביטה בבוהן. הנח את העכבר על גבו או על צדו כדי לגשת לווריד הזנב. השתמש במשחה וטרינרית על עיני העכבר כדי למנוע התייבשות בזמן הרדמה.
3. נגב/רסס את הזנב ב-70% EtOH והזריק 300 מיקרוליטר של LSPCs על וריד הזנב של העכבר באמצעות מזרק אינסולין 26 גרם. התחל להזריק דיסטלי לווריד הזנב וזז קרוב אם הווריד קורס או נקרע.
4. הנח את העכבר בכלוב נקי עד שהוא שומר על שכיבה עצם החזה. אל תניח את העכבר עם חברים אחרים לכלוב עד שהוא יתאושש לחלוטין. עכברים אמורים להתאושש תוך 5 עד 15 דקות. ניתן להניח אותם על כרית חימום או מתחת למנורת חום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף אם ההתאוששות נמשכת זמן רב יותר. יש לעקוב מקרוב אחר עכברים כדי להגן מפני התחממות יתר.
5. עקוב אחר בעל החיים מספר שעות לאחר ההזרקה כדי לוודא שההרדמה מתפוגגת, ואין תופעות לוואי של הטיפול. אפשר ל-LSPCs להסתובב לפחות 24 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterol	Avanti Lipids	700000
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
מתנול	EMD Millipore	113351
N₂ גז	AirGas
סוכרוז	פישר מדעי	S5-500
מכבש	אוונטי ליפידים	610023
מסנני 1.0, 0.4 ו-0.2 מיקרומטר Avanti	Lipids	610010, 610007, 610006