אפיון תאי גזע מזנכימליים מהונדסים גנטית ליישומים נוירותרפיים

Abstract

מקור: Sharma, A. D., et.al. אפיון תפוקה גבוהה של תאי גזע בוגרים שהונדסו להעברת גורמים טיפוליים לאסטרטגיות נוירו-פרוטקטיביות. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את תהליך האפיון של תאי גזע מזנכימליים טרנסגניים שהונדסו לבטא גורמים נוירוטרופיים טיפוליים. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בתיקון, חדירה וצביעה של התאים בנוגדנים ראשוניים ומשניים המכוונים לסמן התפשטות תאים, ולאחר מכן ניתוח באמצעות מערכת סינון בעלת תוכן גבוה כדי ללכוד אותות פלואורסצנטיים בגרעינים. ביטוי מוגבר של סמני התפשטות מאשר את התאמתם של התאים הטרנסגניים ליישומים נוירותרפיים.

Protocol

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. בדיקת התפשטות תאים Ki67

1. בדיקת התפשטות תאים Ki67 (אימונוציטוכימיה)
   1. שטפו את תרביות התאים עם מאגר פוספט 0.1 M (PO₄) למשך דקה אחת פעמיים. תקן את התרבית עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את ה-PFA ושטוף את הבארות עם PBS במשך שבע דקות שלוש פעמים.
   2. לאחר השטיפה האחרונה, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת חוסם (מלח פוספט, 5% סרום חמור רגיל, 0.4% סרום אלבומין בקר ו-0.2% טריטון X-100) לכל באר ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה. הכן את הנוגדן העיקרי, ארנב אנטי-Ki67, על ידי דילול בתמיסת חוסם ביחס עבודה של 1:200.
   3. הסר את תמיסת החוסם ומרח 100 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים העיקרית על כל באר. מכסים את צלחת 96 הבארות ודוגרים את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   4. למחרת, יש להסיר את תמיסת הנוגדנים ולשטוף עם PBS למשך 7 דקות, 3 פעמים.
   5. הכן את הנוגדן המשני, חמור נגד ארנב Cy3 בתמיסת חסימה ביחס עבודה של 1:500. הוסף כתם גרעיני DAPI לתמיסת הנוגדנים המשנית בדילול של 1:100. לאחר הסרת שטיפת ה-PBS האחרונה, יש למרוח 100 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדן/DAPI המשנית על כל באר. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 90 דקות.
   6. הסר את תמיסת הנוגדן/DAPI המשנית ושטוף כל באר עם PBS למשך 7 דקות, 3 פעמים. מכסים את צלחת 96 הבארות ושומרים בחום של 4 מעלות צלזיוס עד להדמיה.

2. הדמיה אוטומטית וניתוח ניקוד רב-אורכי גל

1. טען צלחת של 96 בארות (שעובדה בעבר עבור תיוג חיסוני Ki67) למערכת HCS ואפשר לצלחת להתייצב למשך 20 דקות. פתח את תוכנת רכישת וניתוח התמונות של מערכת HCS.
2. בחר את הגדרות הרכישה עבור המטרה פי 10 באמצעות שילוב מצלמה ב-1 והגדרת רווח של 2. מצא את מישור ה-Z שבו שוכנים התאים על ידי שימוש בפונקציית החשיפה האוטומטית וחשב את ההיסט עבור כל אורך גל מעניין. לצורך ניתוח זה, צלם תמונות עבור DAPI (W1), Cy3 (W2). בחר את רמת העוצמה המקסימלית שבה בארות הבקרה השליליות אינן מראות אות לרכישת תמונה. ודא שהגדרה זו מתאימה לבארות החיוביות.
3. רכוש צלחת. צלם תמונות ואחסן אותן במסד הנתונים של תוכנת רכישת וניתוח התמונות.
4. לאחר רכישת התמונות, פתח תוכנה לא מקוונת לרכישת תמונות וניתוח וסקור נתוני לוחית מהתמונות שנרכשו לעיל.
5. בחר את ניתוח הניקוד של אורכי גל מרובים. הגדר את העוצמות המינימליות והמקסימליות עבור כל אורך גל.
   הערה: זיהוי DAPI צריך לסמן את הצביעה סביב כל גרעין גלוי. Cy3 אמור לזהות את התאים החיוביים עם תגובתיות חיסונית (IR) של Ki67 ולא אמור לזהות IR תחת הבקרות השליליות. עבור Cy3 Ki67 IR, הרוחב המינימלי המשוער היה 7 מיקרומטר, הרוחב המקסימלי המשוער היה 30 מיקרומטר, העוצמה מעל הרקע המקומי הייתה 150 רמות אפור, והשטח המוכתם המינימלי היה 50 מיקרומטר².
6. הפעל ניתוח עבור כל העמדות. ייצא את הנתונים להצגה בגיליון אלקטרוני.

Materials