כריתת גידול מוח בעכבר באמצעות מערכת כריתה זעיר פולשנית

תקציר

מקור: Alomari, S., et al. יישום כריתה זעיר פולשנית של גידולי מוח במכרסמים לאיסוף רקמות בעלות כדאיות גבוהה. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את השימוש במערכת כריתה זעיר פולשנית (MIRS) לכריתת רקמת גידול מעכבר מורדם המושתל בגידול. ההליך כולל אבטחת העכבר על מסגרת סטריאוטקטית, פתיחה מחדש של אתר הניתוח הקודם כדי לגשת למוח, והחדרת צינורית מיוחדת המשתמשת ביניקה ולהב מסתובב כדי להסיר חלקי גידול. לאחר הכריתה, הרקמה שנכרתה נאספת באמצעות צינורות סטריליים, והפצע נסגר כדי לאפשר החלמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. השתלת גידול תוך גולגולתי ראשונית

1. בשלב הראשוני של המחקר, יש להזריק תוך גולגולתי לכל עכבר 100,000 תאים (קו תאי גליומה עכברי GL261) תלויים ב-4 מיקרוליטר של מי מלח עם פוספט (1x PBS) לעומק של 2.5 מ"מ בעקבות הדוח שפורסם בעבר.
2. כמת את אות הגידול בכל עכבר באמצעות מערכת הדמיה in vivo 9 ימים לאחר השתלת הגידול.
   הערה: במידת הצורך, שכבדו את העכברים לשתי קבוצות על סמך עומס הגידול. במחקר הנוכחי, שתי הקבוצות היו: (1) עכברים עם עומס גידול קטן יחסית (אות ביולומינסנט ממוצע = 5.5e+006 ± 0.1e+006 פוטונים/שנייה, n = 10) ו-(2) עכברים עם עומס גידול גדול יחסית (אות ביולומינסנט ממוצע = 1.69e+007 ±-0.2e+007 פוטונים/שנייה, n = 10), (p < 0.05, מבחן מאן-וויטני).
3. חלקו כל קבוצה לשתי תת-קבוצות דומות.
   >הערה: במחקר זה, שתי תת-הקבוצות היו: עכברים לא מטופלים (n = 5) ועכברים עם גידולים שעברו כריתה כירורגית באמצעות MIRS (n = 5), (p > 0.05, מבחן מאן-וויטני).
4. החל מיום הכריתה, עקוב אחר התקדמות הגידול באמצעות מערכת הדמיה in vivo בתדירות המבוססת על דפוס גדילת הגידול.
   הערה: עבור קו תאי GL261, עקוב אחר התקדמות הגידול ביום הכריתה ולאחר מכן כל 3-6 ימים.

2. כריתת גידול באמצעות MIRS

1. הרדמה של העכבר באמצעות תערובת גז איזופלורן-O₂ בתא אינדוקציה או הזרקה תוך-צפקית של תמיסת קסילזין/קטמין.
   1. אם משתמשים בהרדמה בגז, הגדר את קצב זרימת הגז ל-1.0 מ"ל/דקה ואת הוופורייזר ל-2.0% לזירוז הרדמה, בדרך כלל דורש 3-5 דקות בתא (ראה טבלת חומרים).
   2. אם משתמשים בחומר ההרדמה הניתן להזרקה, יש להרדים את העכברים על ידי הזרקת 0.2 מ"ל של תמיסת הרדמה (80-100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10-12.5 מ"ג/ק"ג קסילזין, ראה טבלת חומרים) תוך צפקית.
2. העריכו את בעל החיים להרגעה נאותה על ידי צביטה של הבוהן. מרחו משחה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש בקרנית. יש לתת משכך כאבים (0.03-0.06 מ"ג/ק"ג בופרנורפין תת עורי) לפני ההליך.
3. הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקטית (ראה טבלת חומרים) לאחר אישור הרגעה מלאה.
   הערה: אם אתה משתמש בהרדמה בגז, הנח את האף של העכבר בקונוס אף שבו הוא ימשיך לקבל את תערובת האיזופלורן-O₂ במהלך ההליך (1.5%).
4. הסר את המצרך הקודם, ולאחר מכן הסר את השיער בעזרת קרם אפילציה או על ידי גילוח. חיטוי העור במחזורים מתחלפים של פילינג על בסיס כלורהקסידין/בטדין ואלכוהול. לאחר מכן, בעזרת אזמל סטרילי, צור חתך קו אמצע אורכי של 1 ס"מ לאורך הצלקת הניתוחית הקודמת.
5. חבר את ידית ה-MIRS לזרוע הסטריאוטקטית דרך מתאם הבמה/מחזיק הידית ליציבות ודיוק משופרים.
6. הגדר את מכונת MIRS (ראה טבלת חומרים) באמצעות ההגדרות הבאות (איור 1).
   1. הכנס את כבל החשמל המוגדר בפאנל האחורי לשקע כבל החשמל. הפעל או כבה את החשמל למערכת על ידי החלפת מצב (1 = ON, 0 = OFF).
   2. הכנס קצה אחד של צינור החנקן (המצורף לקונסולה) לתוך האביזר הגברי בפאנל האחורי של הקונסולה. סובב את אום החיבור בכיוון השעון כדי להדק את החיבור.
      הערה: יש לחבר את הקצה הנגדי של הצינור לאספקת החנקן.
   3. לפני חיבור הצינור לאספקת החנקן, ודא שלחץ האספקה אינו עולה על 100 psig, שהוא לחץ אספקת הכניסה המומלץ לקונסולה.
      הערה: הקונסולה תייצר שאיפה משלה כאשר היא מופעלת על ידי דוושת הרגל לאחר אספקת החנקן לקונסולה.
   4. אבטח את המכסה של יציאת הוואקום ואטום אותו כדי למנוע דליפה במערכת הוואקום. כל דליפה במערכת השאיפה תשפיע על ביצועי קונסולת MIRS.
   5. אם השאיפה נמוכה מ-17 במהלך ההתקנה או ההתחלה, בדוק שכפתור השאיפה בחזית הקונסולה מוגדר לרמה המקסימלית (100), ודא שאין דליפה במערכת השאיבה וודא שלחץ אספקת כניסת החנקן תקין.
   6. כדי לחבר את דוושת הרגל לקונסולה, הכנס את מחבר דוושת הרגל האפורה לתוך השקע האפור שלו עד שיילחץ ויתאים למקומו.
      הערה: מחבר דוושת הרגל מתחבר לקונסולה בכיוון אחד, והוא מקודד.
   7. כדי לחבר את הידית לקונסולה, הכנס את מחבר הידית הכחול לשקע הכחול שלו עד שיילחץ ויתאים למקומו.
      הערה: מחבר הידית מתחבר לקונסולה בכיוון אחד, והוא מקודד.
   8. יש להניח כל ידית לפני השימוש במערכת על ידי שאיבת נוזל סטרילי מקערה קטנה לתוך הצמצם, דרך הצינור והידית, ולאחר מכן לתוך המיכל כדי להבטיח שהחלק הפנימי של הצינור והידית משומנים כדי להפחית את חסימות הרקמות.
   9. התכוננו לשאיפה לבד או לשאיפה עם חיתוך על ידי בחירת המצב המתאים בפאנל הקדמי של הקונסולה. התחל באמצעות דוושת הרגל.
7. הכנס את צינורית 23 G MIRS לתוך חור הקוצים לעומק של 2.5 מ"מ.
8. התחל את תהליך הכריתה על ידי לחיצה על דוושת כף הרגל המחוברת לצינורית. בצע מחזור מלא אחד (360°) או יותר של כריתה באמצעות כפתור הבקרה בידית.
   הערה: ככל שבוצעו יותר מחזורים, כך נכרת יותר נפח של רקמת הגידול
.
9. לאחר השלמת תהליך הכריתה, משוך את צינורית ה-23 G MIRS מחור הבור והשתמש ב-5 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את הצינור ולעקור כל פסולת שנותרה.
10. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית וסגור את הפצע בעזרת מהדק או חומר תפירה 4-0 (ראה טבלת חומרים).
11. הנח את העכבר על כרית חימום או תחת אור מחמם במהלך ההתאוששות מההרדמה לפני החזרתו לכלוב שלו.
12. לאחר השלמת הניסוי, נקה את הצינורית באמצעות שטיפה. לסירוגין עם מדיה צוננת ואוויר כדי "לדחוף" את כל הרקמה שנכרתה בחזרה למיכל האיסוף. הסר את מיכל האיסוף מהמערכת ומכסה עם המכסה המצורף.
13. לאחר השלמת שלב 2.12, הנח את הקצה הדיסטלי של הצינורית לתוך 3% H₂O₂ והפעל יניקה ב-24-25 אינץ' כספית כדי למלא את קו היניקה בחזרה למיכל איסוף היניקה ולהניח לעמוד למשך 60-90 שניות. שטוף עם מדיה סטרילית פועמת אוויר ומדיה לסירוגין.
14. עקוב אחר העכברים לאיתור סימנים נוירולוגיים (תנועות חריגות או התקפים) לאחר ההליך.

תוצאות

איור 1: הגדרת מערכת MIRS. (A) מערכת כריתה זעיר פולשנית (MIRS) לגידול מוח במודלים של מכרסמים עם רקמה משולבת מערכת שימור. (ב) לוח קדמי של קונסולת MIRS. 1 = כוח מערכת, 2 = דוושת רגל, 3 = כפתור ראשי, 4 = שאיפה, ...

חומרים