כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. השתלת צינורית סטריאוטקסית
- השתמש בחולדות Sprague-Dawley זכרות בנות 10-12 שבועות.
- להרדים בעלי חיים עם 1.5-2% איזופלורן. ברגע שהחיה מפסיקה להגיב לצביטה חזקה עם מלקחיים חדים, בצע את הניתוח. הקפידו לבצע חיטוי של כל המכשירים, השתמשו בכפפות כירורגיות סטריליות והוסיפו משחה עיניים לעיני החיה כדי למנוע נזק.
- השתלה סטריאוטקסית של צינוריות מנחה דו-צדדיות בגודל 26 לתוך קליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) בזווית של 12.5 מעלות עם קואורדינטות קדמיות (AP): +2.9 מ"מ; מדיולטרלי (ML): +/- 1.6 מ"מ; דורסובנטרלי (DV): -2.1 מ"מ. על מנת להחדיר את הצינוריות, קדחו חורים בגולגולת בקואורדינטות הרצויות, עם קוטר חור בהתאם לגודל הצינוריות בהן נעשה שימוש.
הערה: כאן, קליפת המוח הקדם-מצחית נחקרה כמטרה פוטנציאלית לשתלים תוך גולגולתיים בגלל תפקידה החשוב בעיבוד כאב, שהודגם במספר מחקרים קודמים. כדי לחקור את התפקוד של אזורים מסוימים אחרים במוח, חוקרים יכולים להשתמש בקואורדינטות שונות בהתאם לאטלס המוח. - אפשר לחולדות להתאושש מהניתוח למשך שבוע לפחות. לאחר הניתוח, יש להזריק נוזלים תת עוריים לפני ההחלמה כדי לסייע בתמיכה בדרישות המטבוליות, ולמרוח בופיבקאין מקומי בחתך שזה עתה נסגר. הניחו את החיה על כרית חמה עד להתעוררות, ועקבו אחר החיה לאחר הניתוח למשך 3 ימים כדי להבטיח בריאות טובה והתאוששות תקינה.
- לאחר שבעלי החיים התאוששו לחלוטין מהניתוח, התחל בזריקות (השלב הבא).
2. זריקות תוך גולגולתיות ותוך צפקיות
- להזרקות תוך גולגולתיות, השתמש בצינורות PE-50 המחוברים בקצה אחד למזרקי המילטון של 10 מיקרוליטר עם צינורית מזרק בגודל 33 המשתרעת 1.0 מ"מ מעבר למובילים המושתלים.
- יש להזריק 0.5 מיקרוליטר (או פחות אם רוצים) מתרופת המחקר או מי מלח בקליפת המוח הקדם-מצחית של חולדות אלה. מאחר שקליפת המוח הקדם-מצחית היא אזור גדול יותר בחולדות, הכמות הזו לא תתפשט לאזורים אחרים. אולם עבור אזורי מוח קטנים יותר או עבור עכברים, השתמשו בנפח קטן יותר. הכמות המוזרקת תהיה תלויה באזור המוח ובמין החיה.
הערה: שימו לב שיש להשתמש במי מלח כבקרה במקום דימתיל סולפוקסיד (DMSO) מכיוון ש-DMSO הוא נוירוטוקסיקסי. עם זאת, כמות קטנה מאוד של DMSO עשויה להיות בטוחה לעירוי, מכיוון שמחקרים הראו שפחות מ-50% DMSO (כלומר, פחות מנפח כולל של 0.3 מיקרוליטר, כמו במקרה זה) עשויים שלא להפריע למחקרי התנהגות. - הזריק נפח דו-צדדי לאורך תקופה של 100 שניות ושמור את צינוריות המזרק במקומן למשך 60 שניות נוספות לפני ההסרה כדי לאפשר דיפוזיה איטית של תמיסה זו.
- למחקרים של השפעות פרמקולוגיות סינרגטיות, מתן משותף של תרופה אחרת בשיטות מערכתיות. במקרה זה, יש להזריק את התרופה הרצויה או לשלוט תוך גולגולתית ולתת תרופה נוספת תוך צפקית מיד לאחר מכן. כדוגמה, במחקר זה, חקרנו את ההשפעות הסינרגטיות של משככי כאבים של מורפיום ואמפקינים כדי לבדוק אפקט תוסף. הזרקנו AMPAkine תוך גולגולתי, בשילוב עם אספקה תוך-צפקית של 1 מ"ג/ק"ג מורפיום (מינון סיסטמי בטוח).
הערה: מומלץ לבצע תחילה זריקות תוך גולגולתיות, מכיוון שהן קשות יותר לביצוע מאשר הזרקות תוך צפקיות.
3. מבחנים והערכה לשיכוך כאבים
- כדי לחקור את ההשפעה של זריקות תוך גולגולתיות על התנהגות כאב חריפה בחולדות, השתמש במבחן פלנטר (מבחן הרגריבס) כדי לחשב את חביון הנסיגה בתגובה לגירויים תרמיים. המנגנון של משפחת הרגריבס ממקד קרן אינפרא אדום דרך מישור זכוכית על כף רגלה של החולדה; החולדה עומדת ונעה בחופשיות מעל מישור הזכוכית. בעת ביצוע הבדיקה של הרגריבס, מקד את קרן האינפרא אדום מתחת לאזור הצמח של כף הרגל של החולדה.
- התחל בביצוע בדיקות הבסיס של הרגריבס לפני הזריקות כדי לקבוע ערך בסיס להשוואה.
- אין להזריק שום תרופה מכל סוג שהוא לפני קביעת ערך בסיסי. ערכו חמישה ניסיונות טובים, בהפרש של 5 דקות. ניסוי טוב מסומן על ידי נסיגה ברורה, כלומר, כאשר החולדה מכופפת את ברכה ומרימה את כף רגלה כלפי מעלה ולתוך הגוף.
הערה: ודא שהניסויים נמצאים במרחק של 5 דקות זה מזה כדי למנוע רגישות של החולדה. המנגנון של הרגריבס מתעד אוטומטית את זמן הנסיגה, ברגע שקרן האינפרא אדום נשברת. כתוצאה מכך, הקפד להפחית ניסויים מתנועה, שינוי משקל וכו'. אם מתרחשת גירסת ניסיון מוזלת, המתן 5 דקות וחזור על גירסת הניסיון. - חשב את סף הנסיגה על ידי לקיחת הממוצע של חמשת הניסויים.
- לאחר השגת ממוצע בסיסי, התחל את הניסוי כדי לקבל זמני גמילה לאחר עירוי התרופות. ניתן לבצע את הבדיקות של הרגריבס 20-30 דקות לאחר הזרקות תוך גולגולתיות, אם כי התזמון המדויק עשוי להיות תלוי בפרמקוקינטיקה של החומרים הספציפיים. זאת על מנת להבטיח שהחולדה ספגה את התרופה וחווה את השפעותיה. ערכו את הניסוי הזה באותו אופן כמו שלב 3.1.
- חשב את סף המשיכה כפי שהוזכר בשלב 3.2.
