$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת בעל החיים לניתוח
- בצע פרוצדורות כירורגיות בחלל נקי וייעודי. חיטוי כל המכשירים הכירורגיים, ועיקר עם מעקר חרוזי זכוכית לפני הניתוח.
הערה: בפרוטוקול זה, השתמש בעכברי FVB ביום 10-12 (P10-12) לאחר הלידה. ניתן להשתמש בגילאים שונים ובזנים שונים של עכברים כדי לענות על הצרכים של פרויקט ספציפי. עכברים מבוגרים יותר מ-P40 יכולים להיות מאתגרים מכיוון שעצם הבולה נעשית קשה יותר. - הרדמו את העכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג), קסילזין הידרוכלוריד (10 מ"ג/ק"ג) ואצפרומזין (2 מ"ג/ק"ג). התחל בהכנה כירורגית רק לאחר שהחיה כבר לא מגיבה לגירויים כואבים, כגון צביטה בבוהן. במידת הצורך, יש לתת מנת דחף (חמישית מהמינון המקורי) של קוקטייל ההרדמה כדי להחזיר את מישור ההרדמה המקורי.
הערה: היזהר בשלב זה מכיוון שרוב התמותה שנצפתה בגיל זה נגרמת ממנת יתר של הרדמה. - כסו את עיני החיה במשחת עיניים מגן כדי לשמור על לחות העיניים במהלך ההרדמה, ולדכא את רפלקס המצמוץ של החיה.
- כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה, מקם את העכבר כשצווארו מורחב על כרית חימום לאורך כל ההליך עד שהוא ער לחלוטין.
- לגלח את האזור הפוסט-אפרכסת השמאלי בעזרת קוצץ ולחטא עם 70% אתנול ופובידון יוד לפני מניפולציה כירורגית.
2. ההליך הכירורגי והזרקת וקטור
- השתמש בגישה פוסט-אפרכסת כדי לחשוף את בולה התוף. חתכו את הרקמה התת עורית במספריים קטנים כדי לחשוף את השריר הפוסט-אפרכסת. לאחר החזרת רקמת השומן לצד האחורי של החתך, הפרד את השרירים בצד ימין ושמאל בניצב לחתך כדי לחשוף את העצם הטמפורלית. ודא שהחתך הזה ארוך מספיק כדי לעבוד בנוחות עם הדמיה נאותה.
- חורר את בולה התוף עם מחט 25 גרם והרחיב את החור לפי הצורך בעזרת מלקחיים על ידי קילוף העצם לאחור כדי לאפשר גישה לסיבוב הבסיסי של השבלול, ולאחר מכן הרחב מספיק כדי לדמיין את העורק הסטפדיה ואת קרום החלון העגול (RWM).
- נקב את ה-RWM בעדינות במרכז בעזרת פיפטה נימית בורוסיליקט. שימו לב לשטף נוזלים דרך ה-RWM בשלב זה; זה נורמלי. המתן עד שהשטף יתייצב (הנוזל הנפלט מהשבלול מיובש עם נייר סינון סטרילי).
הערה: היזהר בעת החזקת וקידום מחט הזכוכית כך שניקוב ה-RWM יהיה קטן ככל האפשר. בהתאם למיקרוסקופ המשמש, החזק את הפיפטות באמצעות מיקרומניפולטור או ביד באמצעות מחזיק פיפטה. - הכן את הפיפטות להזרקה באמצעות מושך פיפטות, באותו אופן שמכינים פיפטות מהדק תיקון. ודא שקוטר הקצה גדול (בקוטר של כ-15 מיקרומטר) כך שהזרקת הנגיף פנימה והחוצה תתבצע בקלות.
- משוך 1 עד 2 מיקרוליטר של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP או AAV2-GFP) לתוך פיפטת הזרקה. לאחר ייצוב השטף (5 עד 10 דקות), הזרקו את הנפח הקבוע הזה לתוך הסקאלה טימפאני דרך אותו חור שנעשה בעבר ב-RWM.