$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. השתלת תאים תוך היפוקמפוס
הערה: כל השלבים בסעיף זה מבוצעים מחוץ למכסה המנוע של תרבית התאים במתקן בעלי החיים. השתלה מוקדמת של תאים במוח לאחר הלידה בוצעה על P2, בהתחשב ב-P0 ביום הלידה.
- התכוננו לניסוי ההשתלה על ידי ביצוע השלבים הבאים.
- חיטוי כל החומר הניתוחי או, אם לא ניתן, לעקר בשיטה מאושרת אחרת.
- התקן את מזרק ההזרקה במחזיק ללא נימי זכוכית. שטפו את המחט במים.
הערה: המחט חייבת להיות 33 גרם. - עקומה של 90 מעלות בקצה של מחט אינסולין 30 גרם.
- צרו במה תוצרת בית דמוית Play-Doh למיקום הגור עם הראש שטוח (איור 1A).
- הביאו את כלוב העכברים עם האם והגורים לפני הכנת משהו לניתוח כדי לאפשר להם להתאקלם בסביבה החדשה.
- הכינו מגש עם קרח רטוב וכלוב ריק עם מעט נייר לאיזופלורן.
- להרדים את גור העכברים.
- השרו פיסת נייר באיזופלורן (ראו טבלת חומרים) והניחו אותה בתוך הכלוב הריק. קחו בזהירות גור אחד והכניסו אותו לכלוב כשהנייר ספוג באיזופלורן.
הערה: לעולם אל תשאירו פחות משלושה גורים עם האם. אל תעלה על 20-30 שניות של הרדמה איזופלורן, אחרת הגור עלול למות. - ודא את השפעת ההרדמה על ידי הפסקת תנועה.
- מיד לאחר ההרדמה, הניחו את הגור על טישו רטוב על פני קרח רטוב. החזיקו את החיה על קרח במשך 3 דקות עד שהגפיים העליונות נעשות לבנות (איור 1B, חץ כחול). זה בדרך כלל לוקח 2-3 דקות.
- השתמש בזמן זה כדי להעמיס את המזרק עם מתלה התא. השעו את התאים בזהירות בעזרת פיפטה לפני.
- הנח את הגור על המסגרת הסטריאוטקסית. השתמשו במוטות האוזניים בכיוון ההפוך (איור 1A, חיצים בצבע מגנטה).
הערה: הצד האחורי של מוטות האוזניים פחות מחודד, ומאחר שלגורי P2 אין אוזניים, השתמשו בצד השטוח יותר כדי להימנע מפגיעה בחיה. - מהצד, בדוק אם הראש ישר. הראש חייב להיות שטוח; השתמש בשלב דמוי Play-Doh כדי להסתגל לכך.
הערה: גורים בגיל זה עדיין לא פקחו את עיניהם, כך שאין צורך לנקוט בצעדים נוספים בהקשר זה. לגורים אין פרווה בגיל זה, ולכן אין צורך בגילוח של האזור. לא ניתן טיפול ספציפי בכאב מכיוון שלא מדובר בחתך פתוח בעור, ואין צורך בתפירה. - שמור את הגור מכוסה בקרח (על גבי נייר טישו) למשך כל הניתוח.
הערה: אין להניח את הקרח במגע ישיר עם עור הגור.
- בצע את ההזרקה.
- נקה את פני העור באמצעות רקמה רכה ספוגה באתנול.
- זהה למבדה והגדר את הקואורדינטות לאפס בקונסולת התצוגה הדיגיטלית של המכשיר הסטריאוטקסי (איור 1C, קו מקווקו צהוב). תפרי קשת ולמבדואיד נראים בקלות לעין מכיוון שהם כלי דם כקווים אדומים.
הערה: אם אתם חווים קשיים בהדמיית למבדה, הניחו חתיכת קרח קטנה על העור והמתינו מספר דקות עד שהיא תתקרר. לאחר מכן, הסר את חתיכת הקרח, וההלבנה העדינה של העור תאפשר לך לדמיין. - העבר את מחט ההזרקה לקואורדינטות הרצויות. בפרוטוקול המתואר, האזור הממוקד היה ההיפוקמפוס, והקואורדינטות היו כדלקמן: קדמי-אחורי (AP) +0.85 ומדיו-לטרלי (ML) +1.35.
- השתמש במחט אינסולין מכופפת ב-90 מעלות כדי לחדור לגולגולת וליצור חור זעיר.
- הורידו את מחט ההזרקה עד שהיא חוצה את הגולגולת, ואפסו את הקואורדינטות הגביות-גחוניות (DV). הורד את המחט עד לקואורדינטות ה-DV הרצויות. בפרוטוקול המתואר, הקואורדינטות היו DV -1.1.
- הזרקה לפי מרווחי הזמן שנקבעו מראש.
הערה: בפרוטוקול המתואר, התזמונים המדויקים היו כדלקמן: (i) לאחר הירידה לקואורדינטת ה-DV, המתן 3 דקות, (ii) הזריק 1 מיקרוליטר של נפח למשך 5 דקות, ו-(iii) לאחר הזרקת כל הנפח, המתן 3 דקות. - משוך את המחט לאט.
- סיים את ההליך.
הערה: הניתוח לא יכול להימשך יותר מ-15 דקות כדי להבטיח את הישרדות הגור ולמנוע כל נזק שנגרם מההרדמה על ידי היפותרמיה. - חממו את הגור עם הידיים עד שהוא מתחיל לזוז לפני שתחזירו אותו לאם.
- יש לתת DOX בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל בתמיסת סוכרוז של 0.5% כמי שתייה למשך יומיים לפחות לפני ו-3 שבועות לאחר ההשתלה (PT) כדי להמשיך את התמיינות התאים in vivo.
