העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

תקציר

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

פרוטוקול

1. זריקות DNA מוקדיות
   1. הכן תערובת של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) של וקטורי ביטוי: pCAGGs-IRES-GFP (וקטור בקרה) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר לכל וקטור. הוסף תמיסה ירוקה מהירה (מלאי 25 מ"ג/מ"ל) בדילול של 1/10.
   2. מלאו מיקרו-פיפטה מזכוכית משוכה (קוטר פנימי של 0.5 מ"מ וקוטר חיצוני של 1 מ"מ) ב-10 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA והזריקו כמויות קטנות (בתחום של 25-50 nL) לאזור הנבחר (בולטות גנגליונית מדיאלית או MGE/גנגליון זנב או CGE) של הפרוסה (איור 1 ואיור 2).
2. אלקטרופורציה חריפה
   הערה: יש לבצע את האלקטרופורציה מיד לאחר הזרקת ה-DNA המוקד.
   1. הנח את גוש האגרוז הקטן על אלקטרודת צלחת הפטרי והצמד את עמוד האגרוז לאלקטרודת הכיסוי הניידת באמצעות מיקרו-מרית שטוחה.
   2. העבירו את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה על גוש האגרוז והניחו את האלקטרודה העליונה עם עמודת האגרוז על גבי האזור הנבחר (MGE/CGE) של הפרוסה.
      הערה: מתחי טעינה של V 125 (שני פולסים של ms 5 כל אחד, מרווח של ms 500) יניבו אלקטרופורציה מוצלחת (איור 3).
3. לאחר האלקטרופורציה, מניחים את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה בצלחת ומעבירים אותה לאינקובטור תרבית רקמות CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

תוצאות

איור 1: פרוסות טלנצפליות מייצגות המשמשות לניסויי אלקטרופורציה חריפה. (א-ג) פרוסות טלנצפליות התקבלו בשלוש רמות רוסטרוקאודליות עוקבות נפרדות, מוכתמות ב-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI). LGE: בולטות גנגליונית לרוחב; MGE: בולטות גנגליונית מדיאלית; CGE: בולטות גנג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Medium/Supplements
Neurobasal medium	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	21103-049	Neuron Basic
medium Equipment
אלקטרופורטור	BTX	ECM 830 גנרטור
מזרק לאלקטרופורציה של פרוסה חריפה	Eppendorf	FemtoJet Microinjector
Kite ידני מיקרומניפולטור	WPI	KITE-M3-R
פלטינה Elecrode (I)	Protech International Inc.	CUY-700-1
Platinum Elecrode (II)	Protech International Inc.	CUY-700-2
פלטת בסיס פלדה	WPI	5479
חומר
נימי זכוכית לאלקטרופורציה	VWR	1B100-4
כלי תרבית רקמות איברים	BD Biosciences (Falcon)353037

אחר