העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

1. זריקות DNA מוקדיות
   1. הכן תערובת של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) של וקטורי ביטוי: pCAGGs-IRES-GFP (וקטור בקרה) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר לכל וקטור. הוסף תמיסה ירוקה מהירה (מלאי 25 מ"ג/מ"ל) בדילול של 1/10.
   2. מלאו מיקרו-פיפטה מזכוכית משוכה (קוטר פנימי של 0.5 מ"מ וקוטר חיצוני של 1 מ"מ) ב-10 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA והזריקו כמויות קטנות (בתחום של 25-50 nL) לאזור הנבחר (בולטות גנגליונית מדיאלית או MGE/גנגליון זנב או CGE) של הפרוסה (איור 1 ואיור 2).
2. אלקטרופורציה חריפה
   הערה: יש לבצע את האלקטרופורציה מיד לאחר הזרקת ה-DNA המוקד.
   1. הנח את גוש האגרוז הקטן על אלקטרודת צלחת הפטרי והצמד את עמוד האגרוז לאלקטרודת הכיסוי הניידת באמצעות מיקרו-מרית שטוחה.
   2. העבירו את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה על גוש האגרוז והניחו את האלקטרודה העליונה עם עמודת האגרוז על גבי האזור הנבחר (MGE/CGE) של הפרוסה.
      הערה: מתחי טעינה של V 125 (שני פולסים של ms 5 כל אחד, מרווח של ms 500) יניבו אלקטרופורציה מוצלחת (איור 3).
3. לאחר האלקטרופורציה, מניחים את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה בצלחת ומעבירים אותה לאינקובטור תרבית רקמות CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

איור 1: פרוסות טלנצפליות מייצגות המשמשות לניסויי אלקטרופורציה חריפה. (א-ג) פרוסות טלנצפליות התקבלו בשלוש רמות רוסטרוקאודליות עוקבות נפרדות, מוכתמות ב-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI). LGE: בולטות גנגליונית לרוחב; MGE: בולטות גנגליונית מדיאלית; CGE: בולטות גנגליונית זנבית. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. הכוכביות הצהובות מציינות את אתר האלקטרופורציה בכל פרוסה. הקו הלבן מסמן את קצה הבולטות הגנגליונית.

איור 2: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. (A) פרוסות מוח של עכבר עוברות אלקטרופוזציה עם מבנים מתאימים, ו-(B) אחרי 12 שעות, קודמנים של תאי עצב בקליפת המוח (CI) שעברו שינוי מבודדים, ו-(C) מושתלים בפליום של גורי עכברים שזה עתה נולדו (P0−P2). על מנת לשנות את פעילותם של שתל שבלול לא בשלים, גורי P14 שעברו השתלת תאים הוזרקו CNO או רכב למשך ארבעה ימים מכוננים על פי הפרוטוקול שהוצג. (א') תצלום של מערך האלקטרופורציה של פרוסת מוח העכבר החריפה.

איור 3: ניסוי אלקטרופורציה חריף מוצלח של פרוסות. (A) חתך קורונלי מייצג ממוח עוברי E14.5 שהועבר ב-CGE עם פלסמידים של pCAGGs-IRES-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ו-pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (חלבון פלואורסצנטי אדום) ותורבת במשך 12 שעות. הקטע עבר צביעה חיסונית עבור GFP (A, B, C) ו-RFP (A, B, D). האזור הקופסה בלוח A מוגדל כדי להציג את הביטוי של מדווחים פלואורסצנטיים (B), GFP (C) ו-RFP בלבד (D). הקו הלבן מסמן את קצה הבולטות הגנגליונית. ב-ד: אותה תמונה, ערוצים שונים, או שילוב של שני הערוצים השונים. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A), 100 מיקרומטר (B-D).