מאמר שיטה

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

7 באוגוסט 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. זריקות DNA מוקדיות
    1. הכן תערובת של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) של וקטורי ביטוי: pCAGGs-IRES-GFP (וקטור בקרה) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר לכל וקטור. הוסף תמיסה ירוקה מהירה (מלאי 25 מ"ג/מ"ל) בדילול של 1/10.
    2. מלאו מיקרו-פיפטה מזכוכית משוכה (קוטר פנימי של 0.5 מ"מ וקוטר חיצוני של 1 מ"מ) ב-10 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA והזריקו כמויות קטנות (בתחום של 25-50 nL) לאזור הנבחר (בולטות גנגליונית מדיאלית או MGE/גנגליון זנב או CGE) של הפרוסה (איור 1 ואיור 2).
  2. אלקטרופורציה חריפה
    הערה: יש לבצע את האלקטרופורציה מיד לאחר הזרקת ה-DNA המוקד.
    1. הנח את גוש האגרוז הקטן על אלקטרודת צלחת הפטרי והצמד את עמוד האגרוז לאלקטרודת הכיסוי הניידת באמצעות מיקרו-מרית שטוחה.
    2. העבירו את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה על גוש האגרוז והניחו את האלקטרודה העליונה עם עמודת האגרוז על גבי האזור הנבחר (MGE/CGE) של הפרוסה.
      הערה: מתחי טעינה של V 125 (שני פולסים של ms 5 כל אחד, מרווח של ms 500) יניבו אלקטרופורציה מוצלחת (איור 3).
  3. לאחר האלקטרופורציה, מניחים את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה בצלחת ומעבירים אותה לאינקובטור תרבית רקמות CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

איור 1: פרוסות טלנצפליות מייצגות המשמשות לניסויי אלקטרופורציה חריפה. (א-ג) פרוסות טלנצפליות התקבלו בשלוש רמות רוסטרוקאודליות עוקבות נפרדות, מוכתמות ב-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI). LGE: בולטות גנגליונית לרוחב; MGE: בולטות גנגליונית מדיאלית; CGE: בולטות גנג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Medium/Supplements
Neurobasal mediumGIBCO (ThermoFisher Scientific)21103-049Neuron Basic
medium Equipment
אלקטרופורטורBTXECM 830 גנרטור
מזרק לאלקטרופורציה של פרוסה חריפהEppendorfFemtoJet Microinjector
Kite ידני מיקרומניפולטורWPIKITE-M3-R
פלטינה Elecrode (I)Protech International Inc.CUY-700-1
Platinum Elecrode (II)Protech International Inc.CUY-700-2
פלטת בסיס פלדהWPI5479
חומר
נימי זכוכית לאלקטרופורציהVWR1B100-4
כלי תרבית רקמות איבריםBD Biosciences (Falcon)353037
אחר

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים