הזרקת וקטורים רקומביננטיים הקשורים לאדנו במודל עכבר ניוון שרירים בעמוד השדרה והבולברי

תקציר

מקור:
Pourshafie, N., et al. אספקה מערכתית של מיקרו-רנ"א באמצעות סרוטיפ 9 של נגיף רקומביננטי הקשור לאדנו, לטיפול במחלות עצב-שריר במכרסמים. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה, ניוון שרירים בעמוד השדרה והבולבר או עכבר המושפע מ-SBMA עובר הזרקת וריד זנב של וקטורים רקומביננטיים AAV (וקטורים הקשורים לאדנו) הנושאים פלסמיד המקודד מיקרו-RNA טיפולי. הווקטור מייצר מיקרו-RNA שנקשר למוטציה AR (קולטן אנדרוגן)-mRNA (חומצה ריבונוקלאית שליח), מה שמפעיל את פירוקו. זה מפחית הצטברות חלבון רעיל ועוזר לשפר את התפקוד העצבי-שרירי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הזרקת וריד זנב של פלסמיד AAV-miRNA

הערה: שלב זה זקוק להתאמה בהתאם לגן היעד ולגיל ומשקל העכברים. השתמש בהנחיות הוועדה המוסדית והטיפול והשימוש בבעלי חיים (IACUC) כדי לקבוע את טווח המינון, הנפח ודרך המתן הטובה ביותר בהתבסס על גיל ומשקל העכברים. רמות אות הקרינה של GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) וביטוי miRNA ברקמות המטרה צפויות להגיע לשיא החל משבועיים לאחר ההזרקה. הפרוטוקול הבא מתייחס לעכברים זכרים בבגרות המוקדמת. יש לטפל ב-AAV כמפגע ביולוגי על פי הנחיות בטיחות ביולוגית רמה 1.

1. חלקו את מלאי הפלסמיד AAV-miRNA ל-100-200 מיקרוליטר מכילות עומס נגיפי של 10^{10-10 11} גנומים נגיפיים למ"ל (vg/mL) באמצעות מלח פוספט סטרילי (PBS). יש להשתמש בציוד מגן אישי למעבדה לטיפול בתמיסת AAV.
   הערה: לאחר הפשרת המנה ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים. ניתן לאחסן מלאי ויראלי במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
2. רסנו את העכבר במרסנים הזמינים מסחרית, כגון פלסטיק או שפופרת סרט פלסטיק מחודדת בגודל מתאים.
3. נקו את פני הזנב עם מגבוני אלכוהול 70%.
4. יש להחזיק פד חם (28-30 מעלות צלזיוס) מתחת לזנב למשך 30 שניות כדי להגביר את הרחבת כלי הדם. לחלופין, יש לחמם את בעלי החיים באמצעות מנורת חום אדומה (במרחק של 2-3 מטר) או על ידי טבילת הזנב במים חמים.
5. החל מהחלק הדיסטלי של הזנב, הכנס את המחט (27-30 גרם) עמוסה בנוזל הנגיפי, שיפוע כלפי מעלה, 15 מעלות מהזנב, לתוך הווריד. לפני ההזרקה, ודא שהמחט מוכנסת כהלכה.
   1. אם מורגשת התנגדות במהלך ההזרקה או מופיעה נפיחות מתחת לעור, הפסק את ההליך. הסר את המחט והכנס אותה מחדש מעל אתר ההזרקה הקודם.
      הערה: לחלופין, ניתן להשיג זאת על ידי שאיבת המחט בעדינות והתבוננות בדם. שאיפה קשה עלולה למוטט את וריד הזנב. אם הווריד מסמיק במהלך ההזרקה, המחט מוחדרת כהלכה.
6. לאחר השלמת ההזרקה, המתן מספר שניות לפני הרמת המחט.
7. שימו לב לאתר ההזרקה לאיתור דימום. הפעל לחץ מתון באמצעות שתי אצבעות על המקום עד להפסקת הדימום.
8. החזירו את החיה לכלוב שלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 מ"ל
צינור מיקרוצנטריפוגה	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's פתרון	בקסטר הלת'	0338-0114-04
מיני מערבולת	פישר סיינטיפיק	128101
צנטריפוגה	אפנדורף	22624415
סרט מעבדה	Bemis	PM996
מזרק 1 מ"ל	BD	309626	מגיע עם מחט 25 גרם מחוברת. החלף במחט 27-30 גרם להזרקה
30 גרם מחט	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 מ"ל
מסכת הרדמה	Kopf Instruments	906
גזה	הנרי שיין	100-2524	2 אינץ' x 2 אינץ' (5 ס"מ x 5 ס"מ)
טיפים לפיט	ארה"ב מדעי	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
אידוי הרדמה בגז	SurgiVet	4214322	נבלות
הרדמה בגז	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
כרית חימום	Sears	17280
כרית ספסל	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ הרווארד מנגנון	76-0772	4 חולדות/ 4 עכברים
70% אתנול	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 הוכחה
70% איזופרופנול	VWR	89108-160

קלאסי T3