הזרקה תוך גולגולתית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים במודל עכבר

תקציר

מקור: Liou, C. et al. אספקה תוך מוחית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים בעכברים הנעים בחופשיות. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את ההזרקה התוך-גולגולתית של חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA) בעכבר הנע בחופשיות כדי לחקור את השפעותיהן על התנהגות בתיווך המוח. צינורית מזרק מוחדרת לתוך צינורית מנחה המושתלת במוח העכבר. לאחר ההחלמה, העכבר מתאקלם בכלוב חדש. לאחר מכן ניתנים SCFAs, והתנהגות תנועתית נרשמת.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנה לחיית הניסוי

1. השג עכברים זכרים בני 6-8 שבועות מסוג C57BL/6JNarl ממוכר.
2. שכן את העכברים בכלוב עכברים רגיל עם צ'או עכבר סטנדרטי ומים מעוקרים אד ליביטום.
   הערה: תנאי הדיור של מרכז חיות המעבדה הם טמפרטורת 22 ± 1 מעלות צלזיוס, 55% ± 10% לחות ומחזור אור/חושך של 13 שעות/11 שעות.

2. ניתוח סטריאוטקסי

1. הכן ועקר את המכשיר הסטריאוטקסי, המכשירים הכירורגיים ופריטים נלווים.
   הערה: יש לעקר את כל הפריטים שיגעו ישירות לאתר הניתוח כדי למנוע זיהום.
2. הרדמו את העכבר על ידי הכנסתו לכלוב פרספקס עם 1%-5% איזופלורן בחמצן.
   הערה: התבוננו מקרוב בעכבר כדי לוודא שקצב הנשימה נשמר בסביבות נשימה אחת בשנייה.
3. הוצא את העכבר מתא ההרדמה. לגלח את אתר הניתוח (ראש העכבר) בעזרת גוזם לחיות מחמד. הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית על ידי קיבוע חותכות העכבר על המוט החותך במחזיק החותך הסטריאוטקסי. כסו את האף במסכת האף.
4. להרדים את העכבר עם 1%-2.5% איזופלורן בחמצן לאורך כל הניתוח הסטריאוטקסי. העריכו את הכאב של העכבר באמצעות רפלקס צביטת הבוהן והקפידו על קצב נשימה קבוע לפני חיתוך אתר הניתוח.
5. הנח כרית חימום (37.0 מעלות צלזיוס) מתחת לעכבר על המסגרת הסטריאוטקסית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. לחלופין, שמור על טמפרטורת הליבה בעזרת בדיקה תרמית רקטלית המחברת בין המחמם המתוכנת לכרית החימום.
6. הסר את הפרווה הגזומה על הראש בעזרת סרט דבק. הזריק לעכבר משכך כאבים קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורי כדי להקל על הכאב. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע יובש בעיניים.
7. הכנס את מוט האוזן המחודד לתעלת האוזן כדי לתקן את הראש.
8. מרכז את הראש על ידי התאמת קנה המידה של מוט האוזן.
9. הדק את האף clamp על מחזיק החותך כדי למנוע תנועה אנכית. לחץ על הראש בעדינות כדי לבדוק שהראש מקובע ולמנוע מהראש להשתחרר במהלך הניתוח שלאחר מכן.
10. חטא את הקרקפת עם שלושה קרצוף כלורהקסידין לסירוגין באמצעות צמר גפן. התחילו כל פילינג מהאמצע לכיוון הצד החיצוני (מהאזור המרכזי המחוטא ביותר לאזור הכי פחות מחוטא).
    הערה: השימוש בפילינג מהאמצע לחוץ יכול לעזור למדענים למזער זיהום וזיהום מהפרווה. האזור החיצוני קרוב לאזור הראש הלא מגולח, שעדיין יש בו כמות גדולה של פרווה ולא קל לחטא אותו ביסודיות.
11. חתכו את הקרקפת בצורה קדמית/אחורית (<1 ס"מ) באמצעות להב כירורגי. פתח את החתך ונגב את הגולגולת עם צמר גפן המוחזק על ידי מלקחיים מיקרו-ניתוח.
    הערה: יש לעקר את מלקחיים המיקרו-ניתוחים, להב הניתוח וצמר גפן על ידי חיטוי לפני הניתוח. במהלך התהליך הכירורגי, יש לעקר את כל הציוד הכירורגי באמצעות מעקר חרוזי זכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות לפני ואחרי כל בעל חיים. הכן מעוקרת שתחזיק את להב הניתוח והמלקחיים במהלך התהליך הכירורגי ובין בעלי חיים.
12. זהה את הברגמה והלמבדה על הגולגולת. השתמש בברגמה כסימוכין לאיתור אזור העניין.
    1. אופציונלי: התקן את המקדחה הסטריאוטקסית על מחזיק המקדחה הסטריאוטקסית, והשתמש בקצה המקדחה כדי להצביע על ברגמה כהפניה. עקר את המקדחה הסטריאוטקסית באמצעות מעקר חרוזי הזכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות.
13. כייל ויישר את המישור האופקי של הגולגולת השטוחה במישור השמאלי/ימני והקדמי/אחורי על ידי Bregma/Lambda.
    הערה: אם לא במישור אופקי נכון, הרכיב מחדש את העכבר על המכשיר הסטריאוטקסי.

3. השתלת צינורית מדריך מסחרית מותאמת אישית

1. זהה ותייג את המיקום של החדר הצדדי הימני על סמך הקואורדינטות הסטריאוטקסיות: מרחק לברגמה, קדמי/אחורי (A/P): 0.26 מ"מ, מדיאלי/רוחבי (M/L): -1.0 מ"מ, גבי/גחון (D/V): -2.0 מ"מ.
   הערה: ניתן לשנות את הקואורדינטות על סמך אזור העניין. הקואורדינטות לחדר הצדדי התבססו על עכברי C57BL/6J בוגרים עם טווח משקל של 26-30 גרם.
2. קדחו חור (קוטר = 1.5 מ"מ) דרך הגולגולת באתר המסומן באמצעות מקדחה סטריאוטקסית להשתלת צינורית מדריך מסחרית.
3. קדחו שניים עד ארבעה חורים נוספים (קוטר = 1.5 מ"מ) על הגולגולת באמצעות מקדחה סטריאוטקסית להרכבת ברגי נירוסטה.
   הערה: עקר את המקדחה הסטריאוטקסית באמצעות מעקר חרוזי זכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות לפני ואחרי כל בעל חיים.
4. נגב את שאריות העצם ועצור את הדימום בעזרת צמר גפן.
5. נגב את הגולגולת עם לידוקאין (1 מ"ג/ק"ג) באמצעות צמר גפן להשפעות הרדמה מקומית, נוגדי גירוד ושיכוך כאבים. אם הדימום לא מפסיק לאחר הקידוח, הניחו בעדינות צמר גפן על החור להמוסטזיס.
6. התקן שניים עד ארבעה ברגי אל חלד על החורים כדי לספק עוגנים לאקריליק דנטלי.
7. הנח את צינורית ההנחיה המסחרית על מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית וחטא אותה עם מעקר חרוזי הזכוכית (150 מעלות צלזיוס).
   הערה: צינורית המדריך המסחרית, הדמה המסחרית והמזרק המסחרי (איור 1A) הותאמו אישית עם המפרט המוצג בטבלת החומרים.
8. העבר את מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית לחור שנקדח לחדר הצדדי והכנס לאט את צינורית ההנחיה המסחרית לתוך החור עד לעומק הרצוי (2.5 מ"מ).
   הערה: ניתן להגדיר את הקואורדינטות הגביות/גחוניות על ידי הגדרת קצה צינורית ההנחיה המסחרית כהתייחסות כאשר הקצה בקושי מוכנס לתוך החור.
9. מרחו 10 מיקרוליטר של דבק n-butyl cyanoacrylate (דבק רקמות) כדי לקבע את צינורית ההנחיה המסחרית בחור הקדוח והמתן 3-4 דקות. שחרר את צינורית ההנחיה המסחרית בעדינות ממחזיק הצינורית הסטריאוטקסית והרחיק את המחזיק.
10. מרחו את האקריליק הדנטלי על הקרקפת החתוכה כדי לתקן את צינורית ההנחיה המסחרית והמתינו לפחות 5 דקות. השתלו את הדמה המסחרית בצינורית המדריך המסחרית כדי למנוע סתימת צינורית על ידי דם או נוזל גוף (איור 1B).
11. שחרר את מוט האוזן מתעלת האוזן והסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית.
12. הנח את העכבר בכלוב חדש עם כרית חימום מתחתיו להתאוששות מההרדמה והתבונן ברציפות עד שהעכבר מתעורר לחלוטין.
    הערה: אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת החזה. בעל חיים שעבר ניתוח לא אמור לחזור לחברת בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
13. החזר את העכבר לדיור יחיד או לדיור קבוצתי, בהתאם לפרוטוקול הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ולתכנון הניסוי. לדיור קבוצתי, ודא שפחות עכברים שוכנים בכלוב כדי למזער פציעות לא רצויות או ניתוק הצינורית.
14. יש לתת איבופרופן (0.2 מ"ג/מ"ל) במי השתייה למשך 3 ימים לפחות לטיפול לאחר הניתוח, ולעקוב פעמיים ביום לאיתור סימני כאב ומצוקה למשך 3 ימים לפחות.
    1. במהלך הטיפול שלאחר הניתוח, יש למרוח משחת רוקסיתרומיצין סביב העור כדי למנוע דלקת וזיהום בעכברים.
    2. המשיכו לעקוב אחר מצב החיה ותנו הזרקה תוך-צפקית בזמן של 5% גלוקוז ו/או 0.9% נתרן כלורי כדי לספק מספיק אנרגיה.
    3. אם מצב הכאב, המצוקה או הזיהום מתדרדר בהתמדה, המתת חסד של העכבר על ידי שאיפת CO₂.
15. המתן שבוע לאחר הניתוח עד שהעכבר יהיה מוכן לאספקה תוך מוחית של חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA) ובדיקות התנהגותיות.

4. הכנת SCFAs

1. ממיסים את הנתרן אצטט, נתרן בוטיראט ונתרן פרופיונאט בנוזל מוחי מלאכותי (ACSF) (ראה טבלת החומרים).
2. ודא שהכימיקלים מומסים במלואם, ולאחר מכן התאם את ה-pH ל-7.4, וסנן את תערובת ה-SCFAs דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לעיקור.

5. הגדר את מערכת העירוי לאספקה תוך מוחית של SCFAs במהלך בדיקות התנהגותיות

1. התקן מצלמת תקרה כדי לתעד את ההתנהגות. חבר את המצלמה למחשב כדי לשלוט בתוכנת הקלטת הווידאו (איור 2).
2. מלאו מזרק של 10 מיקרוליטר במים מזוקקים.
   הערה: הימנע מבועות אוויר במזרק המיקרוליטר.
3. חבר משאבת מיקרו-הזרקה עם בקר המיקרו-הזרקה.
4. התקן את מזרק המיקרוליטר על משאבת המיקרו-הזרקה. כדי להתקין את המזרק, לחץ על הכפתור כדי לשחרר את המהדק והתקן את המזרק במיקום המתאים. סגור את clamp והדק את בורג החזקת הבוכנה על משאבת המיקרו-הזרקה (איור 3A).
5. הכנס את המזרק המסחרי לתוך צינור הפוליאתילן (איור 1A).
6. תלו את צינור הפוליאתילן על מצלמת התקרה מעל זירת הבדיקה.
7. מלאו את צינור הפוליאתילן במים מזוקקים באמצעות מזרק אינסולין. חבר את מזרק המיקרוליטר לצינור הפוליאתילן התלוי.
   הערה: ודא שצינור הפוליאתילן ארוך מספיק כדי לאפשר לעכבר לנוע בחופשיות בכל זירת הבדיקה.

6. הגדרות מערכת של בקר המיקרו-הזרקה

1. הפעל את בקר המיקרו-הזרקה ולחץ על הצג את כל הערוצים כדי לגשת למסך הפקודה (איור 3C). לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל-9,800 nL עם קצב אספקה ל-100 nL/s. להחדיר 9,800 nL של מים מזוקקים מצינור הפוליאתילן המחובר למזרק המיקרוליטר (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב Infuse ולחץ על RUN) (ראה ריבועים אדומים במסך הפקודה באיור 3C).
2. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל-3,000 nL עם קצב אספקה ל-100 nL/s. משוך 3,000 nL של שמן מינרלי (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב נסיגה ולחץ על RUN) (ראה ריבועים אדומים במסך הפקודה באיור 3C).
   הערה: יש להקפיד על הפרדת פאזה שקופה של שמן-מים על צינור הפוליאתילן.
3. פרק את צינור הפוליאתילן ממחט המזרק של המיקרוליטר. יש לירוק 3,000 נ"ל של מים מזוקקים ממחט המזרק של המיקרוליטר (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב Infuse ולחץ על RUN).
4. הכנס את מזרק המיקרוליטר בחזרה לצינור הפוליאתילן. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל-9,500 nL עם קצב אספקה של 100 nL/s. משוך 9,500 nL של SCFAs (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב משיכה ולחץ על RUN). סמן את שלב ה-SCFAs של שמן כדי לאמת אם ה-SCFAs מוזרקים בהצלחה.
5. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול הרצוי עם קצב אספקה ל-7 nL/s. לחץ על כיוון כדי לעבור למצב Infuse (ראה ריבועים אדומים במסך הפקודה באיור 3C).
   הערה: קבע את עוצמת הקול על סמך זמן העירוי. לדוגמה, אם זמן העירוי הוא 3 דקות עבור קצב אספקה של 7 nL/s, נפח היעד = 1,260 nL.
6. לחץ על RUN כדי להחדיר את מזרק המיקרוליטר קדימה עד שהנוזל יוצא בקצה הקדמי של המזרק המסחרי לפני הכנסת המזרק לצינורית להזרקת SCFAs.

7. עירוי של SCFAs לחדר הצדדי דרך צינורית ההנחיה המסחרית בעכבר הנע בחופשיות

1. להרדים את העכבר על ידי הנחתו בכלוב פרספקס עם 1%-5% איזופלורן בחמצן.
   הערה: התבונן מקרוב בעכבר כדי להבטיח שקצב הנשימה נשמר בסביבות נשימה אחת לשנייה.
2. קשקש את העכבר והכנס את המזרק המסחרי לתוך צינורית ההנחיה המסחרית (איור 3B).
   הערה: אם צינורית ההנחיה המסחרית מחוברת בדם או בנוזל גוף, פתח אותה בעדינות עם פינצטה.
3. אפשר לעכבר להתאושש מההרדמה למשך 15 דקות בכלוב לפני בדיקה התנהגותית.
4. לבדיקת התנועה הבסיסית, הנח את העכבר בכלוב חדש ואפשר לו לחקור בחופשיות במשך 35 דקות. החדירו SCFAs באמצעות קצב אספקה של 7 nL/s לנפח יעד של 2,100 nL ב-5 הדקות הראשונות (לחץ על כיוון למצב Infuse ולחץ על RUN).
   הערה: ניתן לנתח את התנועה בכלוב החדש באמצעות תוכנת מעקב וידאו של התנהגות בעלי חיים.
5. להרדים את העכבר (חוזר על שלב 7.1) ולהוציא את המזרק המסחרי מצינורית ההנחיה המסחרית.
   הערה: ניתן להזריק לעכבר שוב ושוב בקרות/מטבוליטים שונים לאחר מתן משך הזמן המתאים לשטוף את ההזרקה הקודמת. כל עוד הצינורית מקובעת על ראש העכבר, ניתן לבדוק את העכבר שוב ושוב עם מטבוליטים שונים.

8. שיקום מערכת המיקרו-הזרקה

1. פרק את צינור הפוליאתילן ממזרק המיקרוליטר.
2. הזריק אוויר לתוך הצינור באמצעות מזרק האינסולין כדי להשליך את המים המזוקקים בצינור הפוליאתילן. רוקן את מזרק המיקרוליטר.
3. לחץ על איפוס נקודות במסך התצורה כדי לפתוח את מסך הגדרת דמות עצירת המזרק (איור 3C).
4. לחץ על נסיגה עד שנשמע צליל צפצוף כדי לאפס את משאבת המיקרו-הזרקה למצב הנסיגה המלאה (איור 3C).
5. חזור למסך הפקודה וכבה את בקר המיקרו-הזרקה אם יש סימן **END REACHED** במסך זה (איור 3C).

תוצאות

איור 1: השתלת צינורית המדריך המסחרית בעכברים. (א) תמונה מייצגת של צינורית מדריך מסחרית, בובה ומזרק. (B) התמונה המייצגת של צינורית ודמה מסחרית שהושתלו במוחם של עכברים על ידי קיבוע עם אקריליק דנטלי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Material
Advil Liqui-Gels מסיס איבופרופן A2:D41	Pfizer	n/a
מסנן ואקום עליון לבקבוק, 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר, PES, NEST		סטרילי121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0.14 גרם/ליטר
פילינג כלורהקסידין 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
תמיסת כלורהקסידין	פניקס	NDC 57319-599-09
דמה מסחרית	RWD Life Science	62004	Single_OD 0.20 מ"מ / M3.5 / G = 0.5 מ"מ
קנול מדריך מסחרי	RWD Life Science	62104	Single_OD 0.41 מ"מ-27G/ M3.5/C = 2.5 מ"מ
מזרק מסחרי	RWD Life Science	62204	Single_OD 0.21 מ"מ-33G/ חברים עם M3.5/C = 3.5 מ"מ/G = 0.5 מ"מ
D-(+)-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270	ACSF: 0.61 גרם/ליטר
אקריליק דנטלי	היגייני	n/a
ברגי קיבוע	RWD מדעי החיים	62521
סרום סוסים	ThermoFisher Scientific	16050130
מזרקי אינסולין	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 מ"ל
Isoflurane	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0.19 גרם/ליטר
קטופרופן	שוויצרי פרמצבטי	n/a
לידוקאין	AstraZeneca	n/a
נקודת התכה נמוכה agarose	Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0.19 גרם/ליטר
שקופיות מיקרוסקופ	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
שמן מינרלי קל, לבן NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7.46 גרם/ליטר
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0.18 גרם/ליטר
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1.76 גרם/ליטר
דבק n-בוטיל ציאנואקרילט (דבק דבק רקמות)	3M	1469SB	3M Vetbond
Neural tracer	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
צינור פוליאתילן	RWD מדעי החיים	62329	OD 1.50, תעודת זהות 0.50 מ"מ ו-OD 1.09, תעודת זהות 0.38 מ"מ
Puralube Vet (עין) משחה	Dechra	12920060
נתרן אצטט	Sigma-Aldrich	S2889	SCFAs: 13.5 מ"מ
נתרן אזיד	Sigma-Aldrich	S2002
נתרן בוטיראט	סיגמא-אולדריץ'	B5887	SCFAs: 8 מ"מ
נתרן פרופיונאט	סיגמא-אולדריץ'	P1880	SCFAs: 5.18 מ"מ
צינורית מדריך אל חלד	Chun Ta נירוסטה ארגונית ושות', בע"מ.	n/a	OD 0.63 מ"מ; ספק מקומי
מזרק אל חלד	Chun Ta מפעל נירוסטה ושות', בע"מ	n/a	OD 0.3 מ"מ; דמה עשויה ממזרק; הספק המקומי
Superglue	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
מחזיק צינורית
מכשירים סטריאוטקסיים דיגיטליים	Stoelting	51730D
מיקרוסקופ חיתוך	INNOVIEW	SEM-HT/TW
מעקר חרוזי זכוכית	RWD מדעי החיים	RS1501
כרית חימום	Stoelting	53800M
מיקרו מלקחיים לניתוח	ROBOZ	RS-5136	עקומה משוננת, קלה; עדין במיוחד; רוחב קצה 0.5 מ"מ;
מספריים מיקרו חיתוך	ROBOZ	RS-5918	4.5 אינץ' בקר
מיקרו-הזרקה	מכשירי דיוק עולמיים (WPI)	MICRO2T	SMARTouch בקר
משאבת מזרק מיקרו-הזרקה	מכשירים מדויקים בעולם (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
מזרק מיקרוליטר	המילטון	80014	10 מיקרוליטר
סיבים אופטיים אור קר עם סיבים כפולים	צעד	LGY-150	ספק מקומי
גוזם חיות מחמד	WAHL	09962-2018
תוכנה
התנהגות בעלי חיים תוכנת מעקב וידאו	Noldus	EthoVision	גרסה: 15.0.1416

ציוד RWD Life Science B485-68217 מצלמת תקרה FOSCAM R2 באורך 4 אינץ' חד זוויתי