צינורות זרעי תאי שוואן להתחדשות אקסונלית לאחר פגיעה בחוט השדרה

תקציר

מקור: Lee, Y., et.al. השתלת תאי שוואן בתוך צינורות PVDF-TrFE כדי לגשר על גדמי חוט השדרה של חולדה כדי לקדם התחדשות אקסונים על פני הפער. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את השימוש בצינור פולימרי פיזואלקטרי שנזרע בתאי שוואן כדי לקדם התחדשות אקסונים בחוט השדרה של חולדה שעבר טרנסקטציה. הצינור מספק הנחיה מבנית, בעוד שתכונותיו הביו-אלקטריות מעוררות צמיחת נויריטים. תאי שוואן בתוך הצינור מפרישים גורמים נוירוטרופיים, התומכים בגישור אקסונלי בין גדמי הרוסטרל והזנב.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. חתך ב-T8

1. מקם את המחזיר סביב T7 עד T9. לאחר הסרת כל הלמינות, וודאו כי הפערים בין התהליכים הרוחביים נראים לעין, במיוחד ב- T8. בדוק גם את העצמות לאורך משני הצדדים בין T7 ל-T9 כדי לוודא שאין שברי עצם הבולטים החוצה.
   הערה: פער זה ב-T8 חשוב לביצוע החתך השלם. יש להסיר את החוליות לאורכו לצורך החדרת צינור קלה יותר.
2. חותכים את שורשי הגב והגחון מעל ומתחת ל- T8 בעזרת מספריים קפיציים זוויתיים. הוסף מי מלח לחוט השדרה והמתן עד שהדם ייקרש.
   הערה: שלב זה חשוב להחדרה נכונה של הצינור.
3. הנח את מספרי הקפיץ הזוויתיים מעל חוט השדרה במרווחים בין התהליכים הרוחביים ב- T8 ובצע חתך אחד כדי לנתק לחלוטין את חוט השדרה. מניחים חתיכה קטנה של קצף דחוס לתוך הפער שנוצר של 2-2.5 מ"מ ומוסיפים מיד מי מלח לאזור.

2. הכנסת צינור

1. בזמן ההמתנה שגדמי החוט הקטוע יגיעו להמוסטזיס, הוצא צינור מ-1x PBS. חותכים את משולשי הספיגה לחתיכות דקות וארוכות ומניחים אותם בצינור כדי להסיר עודפי PBS. בדוק שהחלונות שנחתכו מראש פתוחים.
2. הסר מי מלח ודם באמצעות חתיכות דקות וארוכות של משולשי ספיגה. הרם את שני גדמי חוט השדרה באמצעות מיקרו-מרית כדי להבטיח הפרדה טובה. הרם בעדינות את גדם הרוסטרל עם המיקרו-מרית והחלק את הצינור מעל הגדם כשהחלונות פונים לעצמך. ודא שכל הגדם מוכנס ואין דימום עודף לתוך הצינור.
3. הרם בעדינות את גדם הזנב והחלק את הקצה השני של הצינור מעל הגדם. ודאו שכל הגדם מוכנס והחלונות נמצאים על פני השטח הגביים (איור 1A).

3. תא שוואן (SC) / הכנה והזרקה של מטריצה להזרקה

1. בזמן ההמתנה שהחוט המנותק יגיע להמוסטזיס, הסר את המדיום מעל גלולת GFP-SC. השעו מחדש את ה-GFP-SCs ב-10 מיקרוליטר של DMEM/F12 קר. הוסף 10 מיקרוליטר של ג'ל להזרקה קרה לתרחיף התא וערבב היטב על ידי פיפטינג חוזר. שמור את תערובת המטריצה GFP-SC/DMEM/F12/הזרקה על קרח עד להשלמת החדרת הצינור.
2. לאחר שווידאתם שהחלונות על פני השטח הגביים פתוחים (איור 1A), הזריקו 20 מיקרוליטר מתערובת המטריצה GFP-SC/DMEM/F12/הניתנת להזרקה לתוך הצינור דרך אחד החלונות החתוכים מראש באמצעות קצה טעינת כתם מערבי ומיקרופיפטה. אם תערובת המטריצה SC/DMEM/F12/הניתנת להזרקה אמורה למלא יתר על המידה את הצינור, הסר את העודפים בעזרת משולשי ספיגה. סגור את החלונות לאחר ההזרקה; אין צורך בתפירה (איור 1B).

תוצאות

איור 1: סגירת חלון לאחר הזרקת SC/DMEM/F12/matrix. החלונות נפתחים על ידי קיפול לאחור של כל דש לאחר הנחת הצינור בין גדמי הרוסטרל והזנב (A). החלונות נסגרים לאחר ההזרקה (B). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום הנשר השונה של Dulbecco: תערובת נוטריינטים F-12	ThermoFisher Scientific	11039-021	"DMEM/F12" בפרוטוקול.
חולדת פישר נקבה (160-180 גרם)	מספריים Envigo
Vannas, ישר	FST	15018-10
מיקרו מרית	FST	10089-11	יכול להיות כל מותג לבחירה.
מספריים מעוקלים עם קצה קהה	FST	14017-18	יכול להיות כל מותג לבחירה.
מלקחיים קהים	FST	11006-12	יכול להיות כל מותג לבחירה.
Rongeur	FST	16121-14	יכול להיות כל מותג לבחירה.
מספריים קפיציים זוויתיים	FST	15006-09	יכול להיות כל מותג לבחירה.
משולשי ספיגה	FST	18105-03	יכול להיות כל מותג לבחירה.
קצף ג'ל	הנרי שיין	9083300	"קצף דחוס" בפרוטוקול.
#10 להבים	Sklar	06-3010	יכול להיות כל מותג לבחירה.
Matrigel	Corning	354234	"מטריצה להזרקה" בפרוטוקול.