יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

סיכום

בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים M In vivo. שיטה זו מספקת שיטה להבין M-תא לתפקד במערכת החיסונית.

תקציר

החלק הפנימי של המעי שלנו מאוכלס עם מספר עצום של חיידקים commensal. פני הרירית של מערכת העיכול חשופה ברציפות אליהם מדי פעם כדי פתוגנים. רקמת מעי הקשורים הלימפה (Galt) לשחק תפקיד מפתח לזירוז של התגובה החיסונית ברירית אלה החיידקים ^{1, 2.} כדי ליזום את התגובה החיסונית ברירית, אנטיגנים הרירית חייב להיות מועבר מן לומן המעיים על פני המכשול אפיתל לתוך זקיקי הלימפה מאורגן כמו טלאים של Peyer. Transcytosis אנטיגן זה מתווך על ידי תאים מיוחדים M אפיתל ^{3, 4.} תאים M הם תאים אפיתל טיפוסיות כי פעיל phagocytose מקרומולקולות חיידקים. שלא כמו תאים דנדריטים (DCS) וכן מקרופאגים, אנטיגנים אשר היעד lysosomes של השפלה, תאים M בעיקר transcytose אנטיגנים הפנימו. זה transcytosis macromolecular נמרץ באמצעות תאים M מספק אנטיגן אל זקיקי הלימפה הבסיסית מאורגןד הוא האמין להיות חיוני ליזום אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית ברירית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים בקידום זה ספיגת אנטיגן על ידי תאים M אינם ידועים ברובם. יש לנו דיווח בעבר כי גליקופרוטאין 2 (Gp2), הביע במפורש על הממברנה פלזמה apical של תאים M בין enterocytes, משמש לרצפטור transcytotic עבור משנה של commensal ו פתוגניים enterobacteria, כולל coli Escherichia ו סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ס Typhimurium ), על ידי הכרה FimH, רכיב של סוג אני פילי על הממברנה החיצונית חיידקי ^5. כאן, אנו מציגים שיטה ליישום התיקון assay Peyer של העכבר לולאת המעי להעריך את ספיגת חיידקים על ידי תאים ז. שיטה זו היא גרסה משופרת של assay עכבר לולאת המעי שתואר לעיל ^{6, 7.} נקודות לשיפור הן כדלקמן: 1. Isoflurane שימש כסוכן הרדמה. 2. כ 1 ס"מ ligated includ לולאת המעיתיקון ing של Peyer הוקם. 3. חיידקים נלקח על ידי תאים M היו שכותרתו fluorescently ידי מגיב תיוג או על ידי חלבון פלואורסצנטי overexpressing ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). 4. בתאי האפיתל M זקיק הקשורים מכסה תיקון של Peyer התגלו על ידי כל הר immunostainig עם נוגדן אנטי Gp2. 5. Transcytosis פלורסנט חיידקי ידי תאים M נצפו על ידי ניתוח מיקרוסקופי confocal. מעיים המדבקה Peyer של העכבר assay לולאה יכול לספק את התשובה איזה סוג של commensal או חיידקים פתוגניים transcytosed ידי תאים M, ועלולה לגרום לנו להבין את המנגנון המולקולרי של איך לגרות את המערכת החיסונית ברירית באמצעות תאים ז.

פרוטוקול

1. הכנת תאים חיידקיים

1. גליצרול Streak מצויד חיידקים ניאון (כמו ה-GFP לבטא ס Typhimurium) LB על צלחת אגר המכילה 100 מיקרוגרם / מ"ל של אמפיצילין.
2. תרבות מושבה אחת מן אגר LB לילה 2 מ"ל של מדיום LB חדש.
3. הוסף 0.5 מ"ל של תרבית החיידקים עד 4.5 מ"ל של מדיום LB דגירה חדשים עד צפיפות אופטית של 1.0 ב 600 ננומטר הוא הגיע.
4. קציר תאים חיידקיים ידי צנטריפוגה (3000 XG, 5 דק ', 4 ° C).
5. בטל supernatant ולשטוף פעמיים עם 5.0 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חיץ פוספט (PBS).
6. Resuspend גלולה חיידקי עם 5 מ"ל של PBS, ולהשתמש 50 μl של השעיה המכיל כ -10 יחידה ⁷ המושבה להרכיב (CFU) כמו inoculum.
7. במקרה של שימוש בחיידקים שכותרתו fluorescently, התאים חיידקי תויגו על ידי מגיב תיוג הקרינה על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.

2.nesthesia

1. ממלאים קופסת פלסטיק קטנה (10 x 10 x 5 ס"מ) עם 5% (v / v) מתאדה isoflurane מעורבב עם אוויר (קצב זרימה: 200 mL / min).
2. הרדימי שמונה עד שש עשרה חלש בן עכברים זכר או נקבה בתיבה.
3. העבר את העכברים לשולחן נתיחה לאחר הרדמה.
4. ברציפות להרדים את העכברים ב -2% (v / v) מתאדה isoflurane מעורבב עם אוויר (קצב זרימה: 200 mL / min) (איור 1). זהו הליך סופני.

3. לולאה תיקון Peyer Ligated של assay

1. 1cm לחרות של עור הבטן ולאחר מכן לחתוך את הבטן הצפק של עכבר הרדים לקחת את המעי הדק המכיל תיקון של Peyer.
2. ולקשור את המעי עם חוט תפירה, מקפיד להימנע כלי הדם. הערה: רק אחד לאגד צד של המעי, ולהשאיר את הצד השני משוחרר.
3. הזרק 50 μl של השעיה או חיידקי PBS (שליטה) בעזרת מזרק לתוך הלולאה תיקון Peyer של ligated על ים הרופףIDE של המעי (איור 2).
4. Bind צד רופף, קרוב לבטן של עכבר עם קליפ.
5. לאחר h 1, להסיר את ligated של Peyer לולאה תיקון ו להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
6. Peyer והבלו של תיקון מן הלולאה תיקון Peyer של ligated.
7. מהבהב הצד apical של תיקון של Peyer ידי 1ml של PBS עם שימוש במזרק המצורף מחט להסיר עודפי נוזלים ברירית וחיידקים. הברקה תיקון של Peyer נוסף פעמיים.

4. הר מכתים שלמות ניתוח מיקרוסקופי confocal של תיקון של Peyer

1. תיקון של תיקון Peyer בפתרון Cytofix / Cytoperm BD על הקרח עבור שעה 1.
2. לשטוף תיקון של Peyer שלוש פעמים עם 1ml של BD פרם / לשטוף חיץ עבור 5 דקות, ולאחר מכן לחסום עם 1 מ"ל של חיץ חסימת המכיל 0.1% (w / v) saponin, 0.2% (w / v) BSA ב PBS למשך 30 דקות על קרח.
3. הוספת 200 פי בדילול אנטי עכבר GP2 נוגדנים חד שבטיים (5 מיקרוגרם / מ"ל) ל הדגימה כדי לזהותM תאים.
4. דגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
5. לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קר PBS, ולאחר מכן להוסיף 200 פי נוגדן אנטי דילול עכברוש IgG מצומדות עם DyLight549 (20 מיקרוגרם / מ"ל) כדי הדגימה.
6. לדגור על מדגם קרח במשך 2 שעות.
7. לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קר PBS, ולאחר מכן להוסיף 50 פי אלקסה בדילול 633 Phalloidin מצומדות כדי הדגימה כדי לזהות F-אקטין.
8. לדגור על קרח במשך 2 שעות.
9. לשטוף קלות עם 1 מ"ל של קר PBS. אז במקום 3-4 חתיכות זכוכית לכסות מעגלי בשקופית, ולהטביע את הדגימות בתמיסה 30% גליצרול ב PBS בשקופית (איור 3).
10. שימו לב דגימות עם מיקרוסקופ DM-IRE2 confocal סריקת לייזר או שחזור DeltaVision מיקרוסקופ deconvolution.

5. נציג תוצאות:

הדוגמה הדגימה של עכבר ligated לולאה תיקון של Peyer assay עם GFP-S. typhimurium נצפתה עם מיקרוסקופ deconvolution שיקום DeltaVision (איור 4). GFP-S. Typhimurium הוא transcytosed ידי GP2 תאים ⁺ M. מעיים תיקון Peyer של העכבר assay לולאה יכול לזהות סוג של חיידקים פתוגניים commensal או שניתן transcytosed ידי תאים ז.

באיור 1. הרדמה של עכברים בתנאי isoflurane מתאדה. לאייר isoflurane סופקו על ידי מנגנון הרדמה ייעודי (צד שמאל).

באיור 2. סיכום תיקון assay Peyer של ligated לולאה מעיים. המתלים חיידקי פלורסנט היה מוזרק על ידי מזרק לתוך הלולאה תיקון Peyer של ligated בצד רופף של המעי.

איור 4. דוגמה של עכבר ligated לולאה תיקון של Peyer assay עם GFP-Typhimurium ס. GP2, אשר דיווחו כסמן תא ספציפי M ^5, היה מוכתם GP2 נוגדן אנטי עכבר (אדום). הדגימה נצפתה באמצעות מיקרוסקופ deconvolution DeltaVision שיקום. GFP-לבטא ס Typhimurium היה שותף מקומי עם GP2 על הממברנה של התא פלזמה apical M ו שלפוחית ​​cytoplasmic subapical (ראשי חץ). למעלה, apical להציג. התחתונה בצד, נופים לרוחב. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.

דיון

זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקית היא בדרך כלל עבור שעות 1 כדי לבחון את שילוב חיידקים לתאי M. במקרה של דגירה 4 שעות, חיידקים מזוהים לעתים קרובות באזור תא T של טלאים של Peyer. כמו הרדמה מתאדה נשימתית isoflurane יכול לשמור על עכברים יציב, זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקי היא להארכה כדי לבחון את חיידקים אשר לנוע לתוך אזור T-cell בתיקון של Peyer. הנקודה החשובה של ניסוי זה הוא לטפל לא לשרוט את כלי הדם כאשר ligating במעי. במקרה של לא להשתמש ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
LB-אגר אמפיצילין 100	SIGMA	L5667
Cy3 מונו-reactive דיי חבילת	GE Healthcare	PA23001
אלקסה פלואוריד 350 carboxylic חומצה, succinimidyl אסתר	Invitrogen	A10168
שאיפת הרדמה מנגנון	שיננו Seisakusho	SN-487
קיבוע ו Permeabilization פתרון	BD	554722
נגד עכבר גליקופרוטאין 2 נוגדן	MBL	D278-3	200 פי דילול (5μg/ml)
Anti-Rat עיזים IgG, F (ab ') 2 שבר ספציפי	ג'קסון ImmunoResearch	112-505-006	200 פי דילול (20μg/ml)
אלקסה פלואוריד 633 Phalloidin	מולקולרית בדיקות	A22284	דילול של פי 50
Confocal לייזר סריקת מיקרוסקופ	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision שחזור deconvolution מיקרוסקופ	אפלייד Precision	DeltaVision Core