יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

Summary

בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים M In vivo. שיטה זו מספקת שיטה להבין M-תא לתפקד במערכת החיסונית.

Abstract

החלק הפנימי של המעי שלנו מאוכלס עם מספר עצום של חיידקים commensal. פני הרירית של מערכת העיכול חשופה ברציפות אליהם מדי פעם כדי פתוגנים. רקמת מעי הקשורים הלימפה (Galt) לשחק תפקיד מפתח לזירוז של התגובה החיסונית ברירית אלה החיידקים ^{1, 2.} כדי ליזום את התגובה החיסונית ברירית, אנטיגנים הרירית חייב להיות מועבר מן לומן המעיים על פני המכשול אפיתל לתוך זקיקי הלימפה מאורגן כמו טלאים של Peyer. Transcytosis אנטיגן זה מתווך על ידי תאים מיוחדים M אפיתל ^{3, 4.} תאים M הם תאים אפיתל טיפוסיות כי פעיל phagocytose מקרומולקולות חיידקים. שלא כמו תאים דנדריטים (DCS) וכן מקרופאגים, אנטיגנים אשר היעד lysosomes של השפלה, תאים M בעיקר transcytose אנטיגנים הפנימו. זה transcytosis macromolecular נמרץ באמצעות תאים M מספק אנטיגן אל זקיקי הלימפה הבסיסית מאורגןד הוא האמין להיות חיוני ליזום אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית ברירית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים בקידום זה ספיגת אנטיגן על ידי תאים M אינם ידועים ברובם. יש לנו דיווח בעבר כי גליקופרוטאין 2 (Gp2), הביע במפורש על הממברנה פלזמה apical של תאים M בין enterocytes, משמש לרצפטור transcytotic עבור משנה של commensal ו פתוגניים enterobacteria, כולל coli Escherichia ו סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ס Typhimurium ), על ידי הכרה FimH, רכיב של סוג אני פילי על הממברנה החיצונית חיידקי ^5. כאן, אנו מציגים שיטה ליישום התיקון assay Peyer של העכבר לולאת המעי להעריך את ספיגת חיידקים על ידי תאים ז. שיטה זו היא גרסה משופרת של assay עכבר לולאת המעי שתואר לעיל ^{6, 7.} נקודות לשיפור הן כדלקמן: 1. Isoflurane שימש כסוכן הרדמה. 2. כ 1 ס"מ ligated includ לולאת המעיתיקון ing של Peyer הוקם. 3. חיידקים נלקח על ידי תאים M היו שכותרתו fluorescently ידי מגיב תיוג או על ידי חלבון פלואורסצנטי overexpressing ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). 4. בתאי האפיתל M זקיק הקשורים מכסה תיקון של Peyer התגלו על ידי כל הר immunostainig עם נוגדן אנטי Gp2. 5. Transcytosis פלורסנט חיידקי ידי תאים M נצפו על ידי ניתוח מיקרוסקופי confocal. מעיים המדבקה Peyer של העכבר assay לולאה יכול לספק את התשובה איזה סוג של commensal או חיידקים פתוגניים transcytosed ידי תאים M, ועלולה לגרום לנו להבין את המנגנון המולקולרי של איך לגרות את המערכת החיסונית ברירית באמצעות תאים ז.

Protocol

1. הכנת תאים חיידקיים

1. גליצרול Streak מצויד חיידקים ניאון (כמו ה-GFP לבטא ס Typhimurium) LB על צלחת אגר המכילה 100 מיקרוגרם / מ"ל של אמפיצילין.
2. תרבות מושבה אחת מן אגר LB לילה 2 מ"ל של מדיום LB חדש.
3. הוסף 0.5 מ"ל של תרבית החיידקים עד 4.5 מ"ל של מדיום LB דגירה חדשים עד צפיפות אופטית של 1.0 ב 600 ננומטר הוא הגיע.
4. קציר תאים חיידקיים ידי צנטריפוגה (3000 XG, 5 דק ', 4 ° C).

Discussion

זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקית היא בדרך כלל עבור שעות 1 כדי לבחון את שילוב חיידקים לתאי M. במקרה של דגירה 4 שעות, חיידקים מזוהים לעתים קרובות באזור תא T של טלאים של Peyer. כמו הרדמה מתאדה נשימתית isoflurane יכול לשמור על עכברים יציב, זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקי היא להארכה כדי לבחון את חיידקים אשר לנוע לתוך אזור T-cell בתיקון של Peyer. הנקודה החשובה של ניסוי זה הוא לטפל לא לשרוט את כלי הדם כאשר ligating במעי. במקרה של לא להשתמש .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
LB-אגר אמפיצילין 100	SIGMA	L5667
Cy3 מונו-reactive דיי חבילת	GE Healthcare	PA23001
אלקסה פלואוריד 350 carboxylic חומצה, succinimidyl אסתר	Invitrogen	A10168
שאיפת הרדמה מנגנון	שיננו Seisakusho	SN-487
קיבוע ו Permeabilization פתרון	BD	554722
נגד עכבר גליקופרוטאין 2 נוגדן	MBL	D278-3	200 פי דילול (5μg/ml)
Anti-Rat עיזים IgG, F (ab ') 2 שבר ספציפי	ג'קסון ImmunoResearch	112-505-006	200 פי דילול (20μg/ml)
אלקסה פלואוריד 633 Phalloidin	מולקולרית בדיקות	A22284	דילול של פי 50
Confocal לייזר סריקת מיקרוסקופ	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision שחזור deconvolution מיקרוסקופ	אפלייד Precision	DeltaVision Core