גיבוש מערכת נשאת אקסוזומים עמוסה בדופמין

תקציר

מקור: Yavuz, B., et al. גיבוש ואפיון מערכת נשאי דופמין מבוססת אקסוזום. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את הניסוח של אקסוזומים טעוני דופמין, תוך התמקדות בחדירות הממברנה המושרה על ידי ספונין כדי לשפר את אנקפסולציית הדופמין בתוך אקסוזומים.

פרוטוקול

1. העמסת דופמין לאקסוזומים

הערה: לאחר השלמת האפיון של תאי גזע מזנכימליים של ג'לי וורטון (WJ-MSCs), הושגו אקסוזומים עמוסי דופמין כמערכת אספקת תרופות. העמסת תרופות לאקסוזומים מתבצעת בשיטת הדגירה.

1. הוסף 3 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לתרחיף האקסוזום. עקר את המתלה המדולל על ידי סינון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. העבירו 500 מיקרוליטר ממתלה האקסוזום המעוקר לצינור אחר.
2. הכן תמיסת דופמין (0.5 מ"ג/מ"ל) עם מים מזוקקים. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת דופמין לצינורות המכילים את האקסוזומים.
3. הוסף ספונין למתלה בשלב 1.2. דגרו את תרחיף האקסוזום-דופמין המוכן למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הערה: ריכוז הספונין לא יעלה על 0.002% מכלל התמיסה.
4. אולטרה-צנטריפוגה המתלה ב-90,000 × גרם למשך 70 דקות כדי להסיר דופמין וספונין חופשיים מהמדיום. אחסן את האקסוזומים המבודדים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש לניתוח נוסף. הערה: הוסף 0.02% חומצה אסקורבית ליציבות תמיסת הדופמין המוכנה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 מיקרומטר מסנן ממברנה	Aisimo		משמש לתהליך העיקור
15 מ"ל צינור פלקון	קן		בשימוש בתרבית תאים
שלב 50 מ"ל צינור פלקון	קן		בשימוש בתא שלב תרבות
צנטריפוגלי	היטאצ'י	CF16RN	משמש בשלב בידוד האקסוזום
דופמין הידרוכלוריד H8502-10G	סיגמא	H8502-10G	משמש בהעמסת דופמין אקסוזום
אופטימה XPN-100 אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר		משמש בשלב בידוד האקסוזום
טבלית	PBS Biomatik	43602	בהכנת תמיסת PBS
Saponin	Sigma	47036-50G-F	הוא שימש על ידי הוספתו לתמיסה הכוללת בתהליך העמסת הדופמין האקסוזום.
ג'לי וורטון תאי גזע מזנכימליים	ATCC