אינדוקציה אופטוגנטית של דיכאון ארוך טווח לדיכוי התנהגות מחפשת נרקוטיקה בחולדות

תקציר

מקור: Rich, M. T., et al. שימוש באופטוגנטיקה כדי להפוך את הנוירופלסטיות ולעכב חיפוש קוקאין בחולדות. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את השימוש באופטוגנטיקה כדי לגרום לדיכאון ארוך טווח (LTD) בגרעין הגניקולט המדיאלי לסינפסות אמיגדלה לרוחב (MGN-LA), ומחליש התנהגות של חיפוש נרקוטי המושרה על ידי רמזים במודל חולדות. החולדה, שהושתלה בניתוח עם סיבים אופטיים והותמרה ויראלית כדי לבטא תעלות יונים רגישות לאור, עוברת גירוי אופטוגנטי עם פולסים אופטיים בתדר נמוך, מה שמפעיל שחרור נוירוטרנסמיטרים והיחלשות סינפטית. תהליך זה מפחית את ההעברה הסינפטית של MGN-LA באמצעות הפנמת קולטני נוירוטרנסמיטרים, ובסופו של דבר משבש את הקשר בין רמזים להתנהגות של חיפוש סמים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. צנתור תוך ורידי של מכרסמים, העברת וירוסים והשתלת סיבים אופטיים

1. הכינו בעלי חיים לניתוח.
   1. הרדמה מלאה של חולדות עם חומר הרדמה לבחירה על סמך הנחיות מוסדיות. אפשרות אחת היא קטמין הידרוכלוריד (87.5-100 מ"ג/ק"ג, תוך שרירי) וקסילזין הידרוכלוריד (5 מ"ג/ק"ג). ודא שהחולדה מורדמת לחלוטין על ידי בדיקת היעדר רפלקס צביטה בבוהן.
      זהירות: קטמין הוא חומר מבוקר שיש לטפל בו על פי הנחיות מוסדיות.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש בהזרקות תוך שריריות של חומרי הרדמה מכיוון שהן מייצרות השראת הרדמה מהירה ואמינה יותר מאשר הזרקה תוך צפקית. ניטור רציף של הנשימה והתגובה של החולדה ומתן תמיכה תרמית לאורך כל הניתוח.
   2. לגלח אזור גדול בגב החולדה (גב עליון ממש מעל השכמות לאמצע הגב) כמו גם את אזור הצוואר מתחת לגפה הקדמית הימנית והקרקפת.
   3. הניחו את החולדה באזור הניתוח ומרחו פורלובה (דמעות מלאכותיות) על העיניים. יש להזריק נפח משקל גוף של קרפרופן (משכך כאבים) תת עורי (תת עורי [s.c.]) דרך עור הגב העליון, ולאחר מכן להזריק 5 מ"ל של תמיסת Lactated Ringer s.c. דרך עור הגב התחתון.
   4. חטאו את כל אתרי הניתוח על ידי הרטבת חתיכת גזה סטרילית עם בטדין וניגובה באזור הניתוח המגולח בתנועה סיבובית. לאחר מכן חזור על התהליך עם 70% אתנול. חזור על מחזור זה לסירוגין שלוש פעמים.
2. בצע השתלת קטטר תוך ורידי על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר.
   הערה: וילון כירורגי אינו משמש במהלך ניתוח זה כדי למנוע גירוי במהלך השתלת צנתר. עקר את כל המכשירים והציוד לפני השימוש. השתמש בכפפות סטריליות והחלף את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.
3. מיד לאחר השתלת הצנתר, אבטח את החולדה במסגרת סטריאוטקסית לביצוע זריקות וירוס הקשור לאדנו (AAV).
   1. לספק זריקה תת עורית (s.c.) של 2% לידוקאין (0.2-0.3 מ"ל) לקרקפת כהרדמה מקומית.
      הערה: לא נעשה שימוש בהרדמה מקומית במהלך השתלת הצנתר התוך ורידי כדי למנוע שינויים בתוצאות הניתוח.
   2. חבר צינורית הזרקת נירוסטה בגודל 26 למזרק המילטון מלא ב-1 מיקרוליטר של תמיסת AAV מרוכזת: AAV5-hSyn-tdTomato או AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      הערה: oChIEF הוא גרסה של האופסין הרגיש לאור כחול channelrhodopsin (ChR2), שיכול להגיב למגוון רחב של תדרים, ולכן יש לו תועלת לניסויי דיכאון ארוך טווח בתדר נמוך (LTD) שנדונו בפרוטוקול זה, אלא גם לניסויי חיזוק ארוכי טווח (LTP) בתדירות גבוהה. מבנה ה-oChIEF נתרם על ידי ד"ר רוג'ר ציין ועובד לאריזה וטיהור על ידי Duke Viral Vector Core. נדרשים לפחות 3-4 שבועות בין יום ההזרקה ליום האינדוקציה של LTD כדי לאפשר ביטוי אופטימלי של הנגיף בגרעין הגניקולאט המדיאלי של מסופי האקסון של התלמוס (MGN).
      זהירות: באופן כללי, AAV נחשב לאורגניזם ברמת בטיחות ביולוגית 1 (BSL-1), עם סיכון נמוך לזיהום עצמי אלא אם כן נעשה שימוש בנגיף עוזר בייצורו. השימוש בו דורש אישור של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), ויש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) בכל עת בהתאם להנחיות המוסדיות כדי להגביל חשיפה מיותרת.
   3. בעזרת אזמל, בצע חתך של 0.5 מ"מ מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הגולגולת, והסר רקמה מעל כדי לחשוף את פני הגולגולת.
   4. יישר את ראש החולדה בציר הקדמי/אחורי ואפס קואורדינטות סטריאוטקסיות לברגמה.
   5. קדחו שלושה חורים קטנים דרך הגולגולת באמצעות כלי Dremel המצויד במקדח קטן. השתמש במברג כדי להרכיב היטב ברגי נירוסטה (M2x4 965-A2) במקומם.
      הערה: ברגים נחוצים לקשירה נכונה של מלט דנטלי וליצירת מכסי ראש יציבים ועמידים לאורך זמן. יש לפזר את מיקום הברגים על פני הציר הקדמי-אחורי של הגולגולת, והרחק מאתר הזרקת AAV.
   6. קדחו חורים דו-צדדיים להזרקת AAV על סמך הקואורדינטות מאטלס מוח החולדה (Watson and Paxinos) עבור החלק המדיאלי של גרעין הגניקולט המדיאלי (MGN); במ"מ מברגמה, אנטרופוסטריור (AP): -5.4; מדיולטרלי (ML): ±3.0; דורסובנטרלי (DV): -6.6. הורד לאט את צינורית ההזרקה (4 מ"מ לדקה) עד למיקום ב-MGN. הזרקת תמיסת AAV מרוכזת בקצב של 0.1 מיקרוליטר לדקה.
   7. השאירו את צינורית ההזרקה במקומה למשך 5 דקות לאחר השלמת העירויים כדי לאפשר דיפוזיה הרחק מהצינורית ולאחר מכן הוצאו לאט את הצינורית מהמוח.
4. מיד לאחר הזרקת הנגיף, המשך להשתיל סיבים אופטיים המכוונים למסופי MGN-LA.
   1. השתמש בכלי Dremel כדי לקדוח חורים דו-צדדיים עבור שתלי סיבים אופטיים המכוונים לאמיגדלה הצדדית (במ"מ מברגמה, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את החוט של שתל הסיב האופטי ולקבע אותו למתאמים הסטריאוטקסיים כך שהם יוחזקו היטב במקומם.
   3. מורידים לאט את הסיבים בקצב של 2 מ"מ לדקה, עד שקצה הסיב יושב בחלק הגבי של ה-LA (דורסובנטרלי [DV]: -7.9 מ"מ).
   4. אבטח תחילה את הטבעות לגולגולת באמצעות שכבה דקה של דבק מיידי של Loctite, ולאחר מכן מלט דנטלי, וכסה טבעות עם שרוולי טבעת בקוטר 1.25 מ"מ וכיסויי אבק.
      הערה: בחירת הדבק לאבטחת הטבעות לגולגולת צריכה להיות מאושרת על ידי הוועדה המקומית או המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. לוקטיט משמש למחקר זה כדי לאבטח באופן אמין את הטבעות לגולגולת לאחר ניסוי וטעייה עם דבקים מרובים; עם זאת, ניתן לשקול חלופות זמינות.
5. לאחר הליכים כירורגיים, יש לשכן חולדות בנפרד ולספק גישה חופשית למזון ומים. לספק טיפול לאחר הניתוח בהתאם להנחיות המוסדיות. יש לשטוף את הצנתרים מדי יום עם מי מלח המכילים גנטמיצין (5 מ"ג/מ"ל) והפרין (30 USP/מ"ל) כדי לשמור על סבלנות. לפחות 5 ימים לאחר הניתוח ו-24 שעות לפני תחילת הניסויים ההתנהגותיים, המזון מגביל את החולדות ל~90% ממשקל ההזנה החופשית שלהן.

2. ניהול עצמי של קוקאין מכרסם והכחדת מנוף אינסטרומנטלי

הערה: כל ההליכים ההתנהגותיים מתבצעים בתאי מיזוג אופרנטיים סטנדרטיים, המצוידים בשני מנופים נשלפים על קיר אחד, נורת גירוי מעל כל מנוף, מחולל צלילים, תאורת בית ומשאבת עירוי.

1. הכפיפו את החולדות למפגשי אימון יומיים של קוקאין (2 מ"ג/מ"ל) במתן עצמי תחת לוח זמנים של חיזוק ביחס קבוע 1 (FR1).
   1. הניחו חולדות בתא אופרנטי בכל יום ואפשרו לחולדות ללחוץ על מנוף. לחיצה על 'הידית האקטיבית' הייעודית (מאוזנת על פני הידית השמאלית והימנית) מביאה לעירוי קוקאין (1.0 מ"ג/ק"ג/עירוי) והצגת 10 שניות של רמז אור וטון מורכב. ללחיצה על 'הידית הלא פעילה' המיועדת אין השפעות מתוכנתות.
   2. המשך בניסויים במתן עצמי במשך 10 ימים לפחות ועד שהחולדות יזכו בהצלחה לפחות 8 עירויים ליום במשך 3 ימים רצופים. אי עמידה בקריטריונים לרכישה עד היום ה-20 גורמת להרחקה מהמחקר.
2. לאחר עמידה מוצלחת בקריטריוני הרכישה, חשפו את החולדות למפגשי הכחדה אינסטרומנטליים של שעה אחת למשך 6-10 d.
   1. מקמו חולדות בתאים אופרנטיים ואפשרו לחולדות ללחוץ בחופשיות. עם זאת, לתגובות הן על המנוף הפעיל והן על המנוף הלא פעיל אין השלכות מתוכנתות.
   2. בקשו מהחולדות להמשיך בהכחדה אינסטרומנטלית מדי יום עד שמתרחשות בממוצע <-25 לחיצות מנוף במשך יומיים רצופים.

3. אינדוקציה אופטוגנטית in vivo של LTD

הערה: ניסויי עיכוב אופטוגנטיים מתקיימים 24 שעות לאחר היום האחרון של ההכחדה האינסטרומנטלית.

1. חבר כבלי תיקון לדיודת לייזר כחולה של 473 ננומטר באמצעות מפרק סיבובי התלוי מעל כלוב דיור מכרסמים נקי וסטנדרטי כשהכיסוי הוסר. הגדרה זו מאפשרת למכרסמים לנוע בחופשיות ברחבי הכלוב במהלך הגירוי האופטוגנטי.
2. הפעל את דיודת הלייזר בהתאם להוראות ההפעלה והתחבר למחולל דופק. התאם את ההגדרות כך שכאשר היא מופעלת החולדה תקבל 900 פולסים של 2 אלפיות השנייה של אור ב-1 הרץ.
   זהירות: יש להשתמש בהגנה נכונה על העיניים בכל עת בזמן הפעלת הלייזר.
3. מדוד את עוצמת האור דרך כבל התיקון באמצעות חיישן אור. כוונן את עוצמת הלייזר כך שתפוקת האור דרך כבל התיקון תהיה ~5-7 mW.
4. הניחו חולדות בכלוב דיור נקי. הסר כיסויי אבק ושרוולי טבעת, וחשוף את הטבעות. חבר את כבלי המדבקה באופן דו-צדדי לשתלי הסיבים האופטיים. אפשר לחולדות לחקור את הסביבה במשך 3 דקות לפני האינדוקציה בע"מ.
5. הפעל את מחולל הדופק כדי ליזום גירוי אופטוגנטי.
   הערה: למרות שזה לא סביר, אם חולדות חוות תגובות שליליות כלשהן לגירוי, הניסוי מסתיים מיד, והחולדות מורדמות כראוי על סמך הנחיות מוסדיות.
6. לאחר האינדוקציה בע"מ, החזיקו את החולדות בכלוב למשך 3 דקות, ולאחר מכן החזירו אותן לכלובי הבית שלהן.
7. עבור ניסויי בקרה, השתמש באותו הליך גירוי על חולדות המבטאות את נגיף הבקרה AAV5-tdTomato. עבור ניסויים מזויפים, חבר כבל תיקון לסיב האופטי של חולדות המבטא את נגיף AAV5-oChIEF, אך לא מועבר גירוי במהלך מפגש של 15 דקות.

4. בדוק את השפעת הגירוי האופטוגנטי על חיפוש קוקאין המושרה על ידי רמז

1. 24 שעות לאחר גירויים אופטוגנטיים in vivo, החזר את החולדות לתאי מיזוג אופרנטיים. חולדות עוברות מפגש החזרה סטנדרטי של שעה אחת כדי להעריך את התנהגות חיפוש הקוקאין.
   הערה: במהלך החזרה המושרה על ידי רמז, תגובה על הידית הפעילה מניבה הצגה של 10 שניות של הרמז הקשור לקוקאין, אך ללא עירויי קוקאין.
2. בצע בדיקת החזרה שנייה לפחות שבוע לאחר הבדיקה הראשונה כדי לקבוע אם השראת LTD אופטוגנטית מביאה לדיכוי ארוך טווח של חיפוש קוקאין

חומרים