גרימת פגיעה עצבית סיבית בעכבר כדי לחקור התחדשות צומת עצבי-שרירי

תקציר

מקור: Dalkin, W., et al. שיטת הפגיעה בעצב הסיבי: בדיקה אמינה לזיהוי ובדיקת גורמים המתקנים צמתים עצביים-שריריים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים הליך כירורגי לגרימת פגיעה עצבית סיבית בעכבר כדי לחקור התחדשות של צומת עצבי-שרירי (NMJ). ההליך כולל חשיפת העצב הסיבי, הפעלת לחץ מבוקר כדי לגרום לפציעה, והבטחת האפינוריום נשאר שלם כדי לתמוך בהתחדשות אקסונלית. עם הזמן, מקרופאגים מפנים פסולת אקסונלית, מה שמקל על תיקון עצבים והקמה מחדש של NMJs.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת בעלי חיים לניתוח:

1. הרדמת עכברים בתערובת של קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה מפשעתית תת עורית עם מזרק אינסולין סטרילי של 1 מ"ל. תמיסת הנשא מכילה תערובת של 0.9% מי מלח, 17.4 מ"ג/מ"ל קטמין ו-2.6 מ"ג/מ"ל קסילזין. החזירו את בעלי החיים לכלובים בזמן ההמתנה לתרופות שייכנסו לתוקף.
   הערה: אם מינון ההעמסה אינו מספק הרדמה מספקת למשך ההליך, ניתן להזריק 25% נוספים ממנת ההעמסה.
2. עקוב אחר בעלי חיים לאחר ההזרקה כדי לבדוק קצב נשימה יציב ודיכוי מתאים של רמות העוררות. בדוק את רמת העוררות עם צביטה בכף הרגל האחורית, שאמורה לא לעורר תגובה כאשר היא מורדמת מספיק.
   הערה: זה בדרך כלל לוקח 3-5 דקות לעכבר בוגר צעיר בממוצע 25 עד 30 גרם. אם בעל החיים עדיין מגיב לאחר 10 דקות לאחר ההזרקה, ניתן להזריק 25% נוספים ממנת ההרדמה.
3. מרחו משחת עיניים וזלין ושמן מינרלי קל על עיני החיה למניעת יובש. הוציאו בעלי חיים מהכלוב והניחו אותם על משטח נקי וישר. גלח את הגפה האחורית הרצויה מכף הרגל ועד האגן באמצעות גוזם שיער חשמלי, תוך חשיפת ההיבט הצדדי של הגפה בלבד.
4. מרחו מסיר שיער כימי על המקום המגולח למשך דקה אחת. הסירו את השיער באופן ידני באמצעות מגבוני מעבדה. נקו את האזור המנופח בעזרת מגבון מעבדה ספוג באתנול.

2. הליך כירורגי

1. עיקור מכשירים כירורגיים באמצעות חיטוי או שיטה מתאימה אחרת. נקה את אתר הניתוח ואת לוח הניתוח עם 80% אתנול/H₂O. לחטא את אתר הניתוח עם פרובידון. הנח את העכבר על לוח הניתוח ויישר אותו עם מעצורי הגפיים. שמור את הגפה האחורית המטרה במצב טבעי מבחינה אנטומית כאשר מפרק הברך מורחב מעט ללא סיבוב פנימי או חיצוני.
2. הנח את החיה והלוח מתחת למיקרוסקופ הכירורגי. התמצאו לאתר החתך הנכון באמצעות מישוש של ציוני דרך שטחיים, במיוחד מפרק הברך הגרמי והרכס בין שרירי השוקה הקדמית והגסטרוקנמיוס.
3. בצע חתך של כ -3 ס"מ דרך העור באמצעות אזמל או מספריים קפיציים תוך שימוש במלקחיים כלליים לאחיזה. בצע את החתך בניצב למהלך הבסיסי של העצב הסיבי המשותף.
4. המשך את החתך דרך הפאשיה השטחית, וחשוף את שרירי שרירי הזרוע ושרירי ה-vastus lateralis. הפרד את השרירים הללו על ידי חיתוך דרך הפאשיה העמוקה המחברת. חתך של 1-2 ס"מ אמור להספיק.
5. החזר את שריר הזרוע הדו-ראשי בזנב באמצעות מחזירים מכניים, וחושף את העצב הסיבי המשותף.
6. עקוב אחר העצב באופן קרוב עד למציאת הצטלבותו עם גיד הראש הצדדי של שריר הגסטרוקנמיוס.
   הערה: חשיפה עשויה לדרוש מניפולציה נוספת של העור והשריר הנסוגים. צומת זה משמש כנקודת ציון יציבה לפגיעה עצבית.
7. אחזו בעצב בעזרת מלקחיים עדינים, יישרו את הקצוות בצורה מקבילה לגבול הרוחבי של גיד הגסטרוקנמיוס. מועך את העצב הסיבי המשותף על ידי הפעלת לחץ יציב וחזק למשך 5 שניות.
8. לאמת את הריסוק המלא של העצב על ידי בדיקה ויזואלית דרך ההיקף הכירורגי. הוא ייראה שקוף במקום הפציעה. אם משתמשים בעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים באקסונים היקפיים, הקרינה תיעלם ממקום הפגיעה.
9. הסר מחזירים ויישר מחדש את השרירים במקומם האנטומי. סגור את מקום החתך עם 6-0 תפרי משי. מספיקים 1-3 תפרים קטועים פשוטים. הנח את העכבר המתאושש על כרית חימום בכלוב נקי.
10. עקוב אחר כל בעלי החיים במשך שעתיים לאחר הניתוח כדי לבדוק אם יש נשימה וכל תגובה שלילית להרדמה. יש לתת מינון ראשוני של בופרנורפין 0.05-0.10 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה מפשעתית תת עורית מיד לאחר ההחלמה מהניתוח. תן 3 מנות נוספות כל 12 שעות במהלך 48 השעות הבאות. לאחר החלמה מלאה, החזירו את העכברים למתקן לטיפול בבעלי חיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	3437
בופרנורפין	זופארם	1Z-73000-150910
Nair	Nair
מגבוני קים	Kimtech	34155
סכין גילוח חשמלי	Braintree	Scientific CLP-64800
80% EtOH/H₂O
10% פרוביודין
1 מ"ל מספריים קפיציים
	Vannas	91500-09
מס' 15 אזמל	Braintree Scientific	SSS 15
#5 מלקחיים	Dumont	11252-00
6-0 תפר משי על מחט חיתוך הפוכה	תפר אקספרס	752B
מכרסמים חימום כרית	Braintree מדעי	AP-R-18.5
Alexa 555 מצומד אלפא-BTX	בדיקות מולקולריות	B35451
Vectashield	וקטור מעבדות	H-1000
אולימפוס סטריאו זום מיקרוסקופ	אולימפוס	562037192
Zeiss 700 מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss
משאבת זלוף פריסטלטית בזרימה משתנה	פישר סיינטיפיק	13-876-3

של מזרק אינסולין