פיתוח רשת עצבית מהונדסת מיקרו-רקמות באמצעות מיקרו-עמודה מבוססת הידרוג'ל

תקציר

מקור: Struzyna, L. A. et al., רשתות עצביות מהונדסות מיקרו-רקמות תלת מימדיות בהשראה אנטומית לשחזור, אפנון ומידול של מערכת העצבים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את הפיתוח של רשתות עצביות מהונדסות מיקרו-רקמות באמצעות מיקרו-עמוד הידרוג'ל עם ליבת מטריצה חוץ-תאית. אגרגטים עצביים זרועים נצמדים, מרחיבים הקרנות ויוצרים רשתות עצביות מובנות, ותורמים להתקדמות בהתפתחות הנוירולוגית ובמחקר הנוירותרפי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. פיתוח הידרוג'ל אגרוז (מרכיב תאי של רשתות עצביות מהונדסות מיקרו-רקמות (מיקרו-TENNs))

1. הכנת תמיסת אגרוז
   1. בתוך ארון בטיחות ביולוגית, הכינו מאגרים למיקרו-עמודות על ידי העברת 20 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) של Dulbecco לכל אחת משתי צלחות פטרי בגודל 10 ס"מ. עקרו מלקחיים עדינים ומיקרואזמל בעזרת מעקר חרוזים חם.
   2. שקלו 3 גרם אגרוז והעבירו אותו לכוס סטרילית בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. הוסף 100 מ"ל DPBS לריכוז סופי של 3% משקל/נפח (w/v). כלול מוט מגנטי נקי וכסה את הכוס בנייר אלומיניום.
   3. בעזרת פלטה חמה/בוחש, מחממים את הכוס ב-100 מעלות צלזיוס ומערבבים ב-120-200 סל"ד כדי להמיס לחלוטין את האגרוז (התמיסה תהפוך מעוננת לצלולה). שמור על החימום והערבוב לאחר מכן כדי למנוע ג'לציה ושנה את טמפרטורת החימום לפי הצורך כדי למנוע שריפת האגרוז.
      הערה: ייצור הן עם המכשיר לחיתוך לייזר והן עם צינורות נימיים מוצג להלן בסעיפי משנה 1.2 ו-1.3, בהתאמה. המשך לסעיף קטן 1.4 לאחר השלמת השלבים המתוארים בכל אחד מסעיפי המשנה. עבור שתי שיטות ייצור המיקרו-עמודות, הוסף את האגרוז הנוזלי במהירות, מכיוון שהאגרוז מתמצק במהירות כשהוא מתקרר. בעת עיקור עם חיטוי באחד מהשלבים הבאים, השתמש בתנאים הסטנדרטיים החלים על כלי זכוכית.
2. הכנת מיקרו-עמודים באמצעות מכשיר חיתוך לייזר
   הערה: מכשיר חיתוך הלייזר נחתך מאקריליק שקוף באמצעות חותך לייזר CO₂ מסחרי. ייצור מבנים ומכשירים באמצעות חיתוך לייזר מתועד היטב עבור מגוון יישומים הנדסיים ומחקריים. תבנית זו (איור 1) מורכבת ממערך של חמש תעלות גליליות, כל אחת בקוטר של 398 מיקרומטר ואורך של 6.35 מ"מ. מערכים גליליים אלה נוצרים לאורכם על ידי שני חלקים: חצי תחתון (אורך: 25.4 מ"מ, רוחב: 6.35 מ"מ, גובה: 6.0 מ"מ) וחצי עליון (אורך: 31.5 מ"מ, רוחב: 6.35 מ"מ, גובה: 12.7 מ"מ), כפי שמוצג באיורים 1A ו-1B, בהתאמה. ניתן להדק את שני החצאים יחד על ידי המכסים הקדמיים והאחוריים הנצפים באיור 1C (אורך: 31.5 מ"מ, רוחב: 6.35 מ"מ, גובה: 12.7 מ"מ), הכוללים ארבעה חורי יישור החופפים לשני חורים כל אחד בחלקים העליונים והתחתונים ועוזרים לאבטח את כל החלקים יחד כאשר הם מוברגים. מכסים אלה כוללים גם חמישה חורים, קונצנטריים לתעלות הגליליות, אליהם ניתן להכניס את מחטי הדיקור ליצירת לומן של המיקרו-עמודים.
   1. עקר את המכשיר המוצג באיור 1 על ידי כיסויו בנייר אלומיניום וחיטוי. הרכיבו את המכשיר כפי שמוצג באיור 1D על ידי יישור המכסים הקדמיים והאחוריים עם החלק התחתון בלבד ואבטחת שלושת החלקים עם שני ברגים ואומים #4-40 (קוטר הברגה: 3.05 מ"מ) בחורי היישור התחתונים.
   2. הכניסו באופן מלא מחט דיקור סיני (קוטר: 180 מיקרומטר, אורך: 30 מ"מ) לתוך חורי המחט במכסה הקדמי או האחורי של המכשיר (איור 1D). בעזרת מיקרופיפטה, יוצקים מספיק אגרוז נוזלי (~1 מ"ל לחמשת התעלות) על החצי התחתון כדי למלא לחלוטין כל אחד מחצאי התעלה הגלילית.
   3. הנח מיד את החלק העליון של המכשיר מעל החצי התחתון והפעל לחץ עד שהוא יציב במקומו כדי להשלים את התעלות הגליליות (חיכוך בין הכובעים לחלק העליון ישמור על האחרון במקומו). המתן ~5 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הוספת אגרוז כדי לאפשר את הג'לציה שלו בתוך תעלות המכשיר.
   4. חלץ ידנית את המחט מכל אחד החורים במכסי המכשיר. הסר את הברגים והפרד ידנית את שני הכובעים ואת החצי העליון מהחלק התחתון, שם האחרון יחזיק את עמודי המיקרו הידרוג'ל.
   5. השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות את עמודי המיקרו מהתעלות בחצי התחתון ולהניח אותם בצלחת הפטרי שהוכנה בעבר המכילה DPBS (שלב 1.1.1). השתמש מחדש במכשיר לסיבוב נוסף של ייצור מיקרו-עמודים. המשך לסעיף קטן 1.4.
3. ייצור מיקרו-עמודים באמצעות צינורות נימיים
   1. העברת צינורות נימי זכוכית (קוטר: 398.78 מיקרומטר, אורך: 32 מ"מ) לחלק הפנימי של ארון הבטיחות הביולוגית. שברו ידנית את הצינורות הארוכים לשברים של 2.0-2.5 ס"מ והכניסו מחט דיקור אחת (קוטר: 180 מיקרומטר, אורך: 30 מ"מ) לכל שבר (איור 2A).
   2. מעבירים 1 מ"ל אגרוז נוזלי מהכוס אל פני צלחת פטרי ריקה. החזק את צינור הנימים ואת המחט שהוחדרה, הנח קצה אחד של הצינור במגע עם בריכת האגרוז הנוזלית כדי למלא אותה בפעולה נימית. לערבב את הצינור כדי לקדם עלייה נימית.
      הערה: מלאו את צינורות הנימים באגרוז נוזלי גבוה ככל שפעולת הנימים מאפשרת; לאחר מכן, ניתן לחתוך את המיקרו-עמודים הללו למבנים קטנים יותר בהתאם לאורך הרצוי. בריכת האגרוז בנפח 1 מ"ל משמשת בדרך כלל לצינור אחד בלבד מכיוון שהאגרוז מתקרר וג'ל במהירות, ומונע פעולה נימית נוספת.
   3. כאשר הנוזל מפסיק לעלות, הסר את צינור הנימים מהבריכה והניח אותו אופקית על פני צלחת פטרי. המתן 5 דקות כדי לתת לג'ל האגרוז להתיישב בתוך הצינורות.
   4. מקם את האגודל והאצבע המורה משני צידי הצינור ולחץ עליו. השתמש ביד השנייה כדי למשוך במהירות את המחט החוצה תוך שימוש באגודל ובאצבע המורה כדי למנוע מהמיקרו-עמוד עצמו להחליק החוצה מהצינור. הכנס מחט בגודל 30 לתוך הצינור הנימי כדי לדחוף לאט את המיקרו-עמוד החוצה לתוך צלחת המכילה DPBS (שלב 1.1.1).
4. חיתוך ועיקור מיקרו-עמודות
   1. העבירו בעדינות מיקרו-עמודה אחת מ-DPBS לצלחת ריקה באמצעות מלקחיים עדינים. הוסף 10 מיקרוליטר של DBPS לחלק העליון של עמודת המיקרו עם מיקרופיפטה כדי למנוע ייבוש. הנח את המנה האחרונה מתחת לסטריאוסקופ להנחיה חזותית.
      הערה: לאורך הפרוטוקול, ייבוש או התייבשות של מיקרו-עמודים מתייחס לרכישת מבנה מקומט שניתן להבחין בו חזותית מהמראה הטיפוסי והלחות של מבנים אלה. מיקרו-עמודים מיובשים נצמדים היטב לפני השטח של צלחות פטרי ולא ניתן להזיז אותם בקלות, בעוד שמבנים מיובשים נוטים להחליק על פני השטח לאחר מניפולציה עם מלקחיים. תמונת ניגודיות פאזה של מיקרו-עמודה מיובשת לחלוטין מוצגת באיור 3A.
   2. חתוך את עמוד המיקרו בעזרת אזמל מיקרו כדי לקצר אותו לאורך הרצוי (כאן, 2-5 מ"מ). העבר את המיקרו-עמוד הגזוז עם מלקחיים עדינים לצלחת ה-DPBS Petri האחרת שהוכנה בשלב 1.1.1.
   3. חזור על שלבים 1.4.1 ו-1.4.2 עבור כל מיקרו-עמודה מפוברקת.
   4. עקר את המיקרו-עמודים בצלחות הפטרי המכילות DPBS באור אולטרה סגול (UV) למשך שעה. אחסן את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הוספת מטריצה חוץ-תאית (ECM) וציפוי תאים.

2. תרבית נוירונים ראשונית ושיטת צבירת תאים מאולצת

1. הכנת מערך המיקרו-באר הפירמידלי
   הערה: בחלק זה נעשה שימוש בתבנית מודפסת בתלת מימד המורכבת מבסיס גלילי (קוטר: 2.2 ס"מ, גובה: 7.0 מ"מ) ותשע פירמידות מרובעות למעלה (אורך צד: 4.0 מ"מ, זווית שיפוע: 60°), מאורגנות במערך של 3 x 3, כפי שמוצג באיור 1E. תהליך הייצור התוסף באמצעות מדפסות תלת מימד זמינות מסחרית מתועד היטב. ניתן להשתמש בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב לעיצוב התבנית. לאחר מכן ניתן להמיר דיגיטלית את קובץ העיצוב שנוצר לנתיב כלי עבור מדפסת תלת מימד. לכל מדפסת מפרט שונה, וההוראות להתקנה ותפעול של מדפסת תלת מימד משתנות בהתאם.
   1. השתמש במקדחה בגודל 3/32 אינץ' כדי לנקב 16 חורים במערך של 4 x 4 (אורך צד: 4 ס"מ, הפרדת חורים: 1 ס"מ), ממורכז במכסה של צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ. בתוך מכסה אדים כימי, השתמש בחלק התחתון של צלחת הפטרי כדי לשקול 27 גרם פולידימתילסילוקסן (PDMS) ו -3 גרם חומר ריפוי (ביחס של 1:10). מערבבים בעזרת מיקרו-מרית כדי להפיץ את הסוכן באופן שווה.
   2. כסו את ה-PDMS/חומר הריפוי במכסה המנוקב. חבר קצה אחד של צינור ליציאת הוואקום של מכסה האדים והכנס את הקצה השני לגזע המשפך (קוטר הפה: 10 ס"מ, אורך הגבעול: 3 ס"מ, קוטר הגבעול: 1.5 ס"מ).
   3. צור פתח עם מקדחה בגודל 3/32 אינץ' בחלק העליון של נורת פיפטה של 1 מ"ל והכנס ואבטח קצה מיקרופיפטה של 1,000 מיקרוליטר לתוך הפתח (כשהקצה המחודד כלפי מעלה). הנח את הנורה והקצה לתוך הצינור ומשוך את הצינור כלפי מעלה עד שהנורה אוטמת את הצינור לתוך גזע המשפך.
   4. הנח את המשפך על מכסה הכלי המנוקב ואבטח את הצינור עם תמיכה יציבה זמינה. פתח את שסתום הוואקום למשך 5 דקות כדי לשאוב ולהביא את בועות האוויר אל פני השטח.
   5. סגור את השסתום, הסר את המשפך ופגע בצלחת הפטרי על פני מכסה המנוע ~ 3 פעמים כדי לפוצץ את כל בועות האוויר שנותרו.
   6. הניחו תבנית מודפסת בתלת מימד של באר פירמידה בכל אחת מהבארות בצלחת תרבית של 12 בארות, כשהפירמידות פונות כלפי מעלה. יוצקים את ה-PDMS/חומר הריפוי על גבי התבניות עד שכל באר של הצלחת מתמלאת. מכסים את צלחת 12 הבארות במכסה ומעבירים לתנור למשך שעה בחום של 60 מעלות לייבוש.
   7. הסר בזהירות כל מערך מיקרו-בארות PDMS (איור 1F) מהצלחת בעזרת מיקרו-מרית. מכסים את מערכי ה-PDMS בנייר אלומיניום ומעקרים אותם על ידי חיטוי. בתוך ארון בטיחות ביולוגית, הכניסו מערך מיקרו-בארות אחד לכל באר של לוח 12 בארות (איור 2B).
2. בידוד נוירונים בקליפת המוח מעוברי חולדות
   1. הוסף ~20 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לכל אחת מארבע עד שש צלחות פטרי בגודל 10 ס"מ (אחת לכל רקמה שנותחה) בתוך ארון בטיחות ביולוגית. העבירו את הכלים הללו למכסה המנוע והניחו אותם על קרח. עקר מכשירי דיסקציה, כגון מיקרו אזמלים, מספריים ומלקחיים, בעזרת מעקר חרוזים חם.
   2. מדיום בסיס של נוירון עוברי חם מראש + 2% תוסף ללא סרום + 0.4 מ"מ L-גלוטמין (להלן "מדיום תרבית") ו-0.25% טריפסין + 1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ב-37 מעלות צלזיוס. הכן 1.5 מ"ל של תמיסת DNAse I של 0.15 מ"ג/מ"ל ב-HBSS ושמור את התמיסה על קרח.
   3. המתת חסד של חולדה בהריון עוברי בגיל 18 על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואישור מוות על ידי עריפת ראש. העבירו את הפגר למכסה מנוע דיסקציה סטרילי והניחו אותו עם הצד הגחוני כלפי מעלה. שוטפים היטב את הבטן עם 70% אתנול.
   4. פתחו את הרחם והוציאו את העוברים (בדרך כלל ~11) משקי מי השפיר בעזרת מספריים והעבירו אותם בעזרת מלקחיים לצלחת פטרי המכילה HBSS קר, כמתואר. הנח גוש גרניט צונן (-20 מעלות צלזיוס) מתחת לסטריאוסקופ. הנח את צלחת הפטרי על פני הגוש הקר הזה כדי לשמר את הטמפרטורה הנמוכה של HBSS לאורך כל הליך הדיסקציה.
   5. שטפו את הגורים על ידי סיבוב ה-HBSS ואז העבירו אותם לכלי הנקי הבא המכיל HBSS. בעזרת הסטריאוסקופ ומכשירי הדיסקציה, הסר ברצף את הראשים, חצאי המוח וקליפת המוח של העוברים והעביר כל רקמה בעזרת מלקחיים לצלחת חדשה מלאה ב-HBSS לאחר כל דיסקציה.
   6. שאפו רק את קליפות המוח בעזרת פיפטה של פסטר והניחו את הרקמה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל. השליכו את שאר הרקמות המנותחות. שטפו את קליפת המוח שלוש פעמים על ידי הוספה והסרה של ~5 מ"ל של HBSS ברצף בעזרת פיפטה סרולוגית. הנח את הצינור על קרח כאשר אינו בשימוש.
   7. העבירו את הקורטיקה עם פיפטה פסטר לצינור של 15 מ"ל המכיל טריפסין-EDTA מחומם מראש (4-6 קליפות לכל 5 מ"ל טריפסין-EDTA). מערבבים ידנית את הצינור פעם אחת ומניחים אותו ב-37 מעלות צלזיוס. הפוך את הצינור כל 3 דקות כדי למנוע מהרקמה להתגבש.
   8. הפסק את החשיפה לטריפסין לאחר ~10 דקות על ידי הסרת הרקמה עם פיפטה של פסטר והעברתה לצינור צנטריפוגה נקי של 15 מ"ל. הוסף את תמיסת ה-0.15 מ"ג/מ"ל DNase I (1.5 מ"ל) לצינור בעזרת פיפטה.
   9. השתמש בפיפטה של פסטר כדי לפרק ידנית גושי רקמות ולאחר מכן מערבולת (~30 שניות) עד שהתמיסה נראית הומוגנית ולא נותרו שברי רקמה בנוזל. אם לא ניתן להומוגניזציה מלאה של התמיסה, חלץ את השברים הבלתי מסיסים על ידי משיכתם לקצה פיפטה פסטר.
   10. צנטריפוגה תמיסת התאים ההומוגנית המתקבלת בשלב 2.2.9 ב-200 x גרם למשך 3 דקות. הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה פסטר, תוך הקפדה לא להפריע לתאים הגלולים. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית עם פיפטה סרולוגית ומערבולת כדי להשעות מחדש את התאים.
   11. ספרו את מספר התאים בתמיסה שהוכנה בשלב 2.2.10 באמצעות המוציטומטר; התשואה הצפויה היא 3.0-5.0 x 10⁶ תאים/חצי כדור קליפת המוח. הכן 1 מ"ל או יותר של תרחיף תאים במדיום תרבית, בצפיפות של 1.0-2.0 x 10⁶ תאים/מ"ל.
3. היווצרות אגרגטים של תאים עצביים
   1. בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 12 מיקרוליטר של תרחיף התאים בגודל 1.0-2.0 x 10⁶/mL לכל מיקרו-באר של מערך ה-PDMS (שהונח בצלחת בשלב 2.1.7).
      הערה: ניתן לכוונן את ריכוז התאים בהתאם לקוטר הפנימי של המיקרו-עמודה ולגודל הצבירה הרצוי של התא, מכיוון שריכוזים גבוהים יותר מניבים אגרגטים גדולים יותר.
   2. צנטריפוגה של הצלחת ב-200 x g למשך 5 דקות כדי לאלץ צבירה של תאים בתחתית המיקרו-בארות (איור 2B). הוסף בזהירות ~2 מ"ל של מדיום תרבית לחלק העליון של כל מערך PDMS כדי לכסות את כל בארות המיקרו הזרועות, תוך הקפדה לא להפריע לתאים המצטברים.
   3. דגרו את הצלחת למשך 12-24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.

3. פיתוח המרכיב הסלולרי של ייצור ליבת ECM של מיקרו-TENNs

1. 1. לאחר הדגירה המצטברת, הוסף קולגן ולמינין מסוג I למדיום התרבית (לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל כל אחד) בצינור מיקרו-צנטריפוגה להכנת תמיסת ה-ECM. בצע את שלבים 3.1.2-3.1.4 בטמפרטורת החדר, אך שמור את הצינור עם ECM על קרח כאשר אינו בשימוש כדי למנוע ג'לציה מוקדמת.
      הערה: ההוצאה האופיינית היא 4 מיקרוליטר של תמיסת ECM לכל מיקרו-עמודה (אורך: 5 מ"מ, ID: 180 מיקרומטר).
   2. התאם את ה-pH של תמיסת ה-ECM על ידי העברת 1-2 מיקרוליטר לנייר לקמוס כדי לאמת את ה-pH הראשוני, הוספת 1 מיקרוליטר של 1 N נתרן הידרוקסיד (NaOH) ו/או 1 N חומצה הידרוכלורית (HCl) ל-ECM, לפי הצורך, וחזור על הפעולה עד שה-pH הוא 7.2-7.4. הקפידו על הומוגניזציה של תמיסת ה-ECM על ידי פיפטינג למעלה ולמטה תוך הימנעות מהיווצרות בועות אוויר.
   3. העבירו את המיקרו-עמודים בעזרת מלקחיים מעוקרים מהכלים בשלב 1.4.3 לריקון צלחות פטרי בגודל 35 או 60 מ"מ. עבדו על 4-5 מיקרו-עמודים בכל פעם כדי למנוע התייבשות. חבר קצה של 10 מיקרוליטר לקצה של 1,000 מיקרוליטר למיקרופיפטה. בעזרת הסטריאוסקופ להנחיה חזותית, הנח את הקצה בקצה אחד של המיקרו-עמודים ושאיבה כדי לחלץ שאריות DPBS ובועות אוויר מהלומן.
   4. צייר במהירות 4-5 מיקרוליטר של ECM במיקרופיפטה. התבוננות תחת סטריאוסקופ, הנח את קצה המיקרופיפטה באחד מקצות המיקרו-עמודים ושחרר מספיק ECM כדי למלא את הלומן. אשר את היעדר בועות אוויר בלומן, מכיוון שאלו עלולות לעכב צמיחה אקסונלית דרך ה-ECM. אם קיימות בועות אוויר, הסר את ה-ECM, כפי שהוסבר בשלב 3.1.3, והוסף שוב את ה-ECM.
   5. כדי למנוע התייבשות, הוסף ~2 מיקרוליטר של ECM סביב כל מיקרו-עמודה. דגרו את המיקרו-עמודים של הידרוג'ל/ECM בצלחות הפטרי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 25 דקות. המשך לזריעת תאים מיד לאחר הדגירה.
      הערה: תקופת הדגירה בשלב 3.1.5 נועדה לאפשר זמן לפילמור של קולגן ולמינין בתוך עמודות המיקרו.
2. זריעת תאים עצביים במיקרו-עמודים
   הערה: כדי לשנות את מצע התרבות של האגרגטים המועברים, הטה את הצלחת, השתמש במיקרופיפטה כדי להסיר את המדיום שמצטבר על דופן הבאר, ולאחר מכן הוסף לאט ~1 מ"ל כנגד הקיר (כדי למנוע הפרעה לאגרגטים במיקרו-בארות הפירמידה). חזור על שינוי מדיום זה בפעם השנייה.
   1. לאחר תקופת הדגירה בשלב 3.1.5, העבירו כ-10-20 מיקרוליטר של מדיום תרבית לשני אזורים פנויים בצלחות הפטרי המחזיקים את המיקרו-עמודות. השתמש במיקרופיפטה כדי להעביר בנפרד את האגרגטים לצלחת פטרי המכילה את המבנים ולהעביר אותם עם מלקחיים לאחת המאגרים הקטנים של מדיום התרבית כדי לשמור על בריאות התא.
   2. תוך כדי התבוננות תחת סטריאוסקופ, הכנס אגרגט בכל קצה של עמודות המיקרו עבור מיקרו-TENNs דו-כיווניים או בקצה אחד לארכיטקטורה חד כיוונית (כרצונך) באמצעות מלקחיים. אשר את מיקום האגרגטים בתוך המיקרו-עמודות באמצעות הסטריאוסקופ. השתמש במלקחיים כדי להעביר את המיקרו-עמודים הזרעים למאגר הקטן השני של מדיום התרבית כדי למנוע התייבשות ולשמור על בריאות המצטברים.
   3. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 45 דקות כדי לאפשר לאגרגטים להיצמד ל-ECM. ודא שהאגרגטים נשארים בקצות המיקרו-עמודות באמצעות הסטריאוסקופ; הציגו מחדש את צברי התאים וחזרו על שלב הדגירה לפי הצורך.
   4. הציפו בזהירות את צלחות הפטרי המכילות את המיקרו-TENN במדיום תרבית (3 או 6 מ"ל לצלחת פטרי 35 או 60 מ"מ, בהתאמה) באמצעות פיפטה סרולוגית. מניחים את הכלים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו -5% CO₂ לתרבית ארוכת טווח.
   5. בצע החלפת חצי מדיה כל יומיים עם מדיום תרבית. הסר בזהירות מחצית מהמדיום הישן בעזרת פיפטה והשתמש בסטריאוסקופ להנחיה חזותית כדי למנוע יניקה של המיקרו-טנים. מחליפים בהוספה איטית של מדיום טרי ומחומם מראש עם פיפטה.

תוצאות

איור 1: שרטוטים של מכשיר ייצור המיקרו-עמודות בחיתוך לייזר ותבנית המיקרו-באר הפירמידלית המודפסת בתלת מימד לצבירת תאים. (A)-(B) שרטוט ותמונה של החצי התחתון והחלק העליון של מערך התעלות הגליליות, בהתאמה, המשמשים לייצור המיקרו-עמודים של ההידרוג'ל. (ג) שרטוט ות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חותך לייזר	מערכות לייזר אוניברסליות	PLS4.75	משמש לייצור תבנית המיקרו-ערוצים החתוכה בלייזר.
מכשיר לייצור מיקרו-עמודים בחיתוך לייזר	בהתאמה אישית	--------------	צור קשר עם קבוצת המחקר שלנו אם אתה מעוניין. מידות ושרטוטים מסופקים בכתב היד.
ברגים	--------------	--------------	#4-40 בקוטר הברגה של 3.05 מ"מ
אגוזים	--------------	--------------	#4-40 בקוטר הברגה של 3.05 מ"מ
מחט דיקור סיני (קוטר 180 מיקרומטר)	לאסה רפואי	sj.16X40	הקוטר עשוי להשתנות בהתאם לגודל הרצוי עבור לומן המיקרו-עמודה.
צלחת פטרי	פישר	08772B
תמיסת מלח פוספט חוצץ פוספט (DPBS) של	Invitrogen	14200075
פוליסטירן פישר		13-678-11D
אגרוז	סיגמא	A9539-50G
צינור נימי (קוטר 398 מיקרומטר)	פישר	21170D	הקוטר עשוי להשתנות בהתאם לגודל הרצוי למעטפת המיקרו-עמודה.
פלטה חמה	פישר	SP88857200
בר מגנטי	פישר	1451352
מיקרופיפטה	סיגמא	Z683884-1EA
25 מ"מ מד מחט	פישר	14-826-49
מיקרואזמל	Roboz כירורגי	RS-6270
מספריים	מדעיים	עדינים14081-09
מכשירי דיוק עולמיים	מלקחיים	501985
מעקר חרוזים חם	סיגמא	Z378550-1EA
סטריאוסקופ	ניקון	SMZ800N	משמש לכל שלבי החיתוך ולייצור מיקרו-TNN.
354236 קולגן מסוג I של זנב חולדה			יש לשמור על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהסיר רק בעת הצורך. השתמש בקרח כדי לשמור על הטמפרטורה שלו בעת השימוש.
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר	02-681-256
עכבר למינין	קורנינג	354232	שמור על 4 מעלות צלזיוס והסר רק בעת הצורך. השתמש בקרח כדי לשמור על הטמפרטורה שלו בעת השימוש.
מדיום נוירו-בסיסי	Invitrogen	21103049	מדיום בסיסי לתרבית של תאים עצביים טרום לידתיים ועובריים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולחמם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	פישר	SS2661
חומצה הידרוכלורית (HCl)	פישר	SA48-1
נייר לקמוס	פישר	09-876-18
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	חנות Invitrogen	14170112	בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולחמם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
דאוקסיריבונוקלאז לבלב בקר (DNase) I	Sigma	10104159001	יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולחמם ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
תוסף B-27	Invitrogen	12587010	נוסף למדיום הנוירו-בסיסי לתרבית נוירונים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולחמם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
L-גלוטמין	Invitrogen	35050061	יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולחמם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
ספראג דולי יום עוברי 18 חולדות	צ'ארלס ריבר	זן 001
פסטר	פיפטה פישר	22-042816
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	EMESCO	1194-352099
וורטקס	פישר	02-215-414
צנטריפוגה	פישר	05-413-115
המוציטומטר	פישר	02-671-6
Objet30 מדפסת תלת מימד	Stratasys	--------------	משמש לייצור תבניות המיקרו-באר הפירמידליות.
עובש באר פירמידלי מודפס בתלת מימד	בהתאמה אישית	--------------	צור קשר עם קבוצת המחקר שלנו אם אתה מעוניין. מידות ושרטוטים מסופקים בכתב היד.
פולידימתילסילוקסן (PDMS) וחומר ריפוי	פישר	NC9285739	מגיע כערכה עם אלסטומר וחומר ריפוי. השתמש בתוך מכסה אדים כימי.
משפך	פישר	10-348C
1 מ"ל נורת פיפטה	סיגמא	Z509035
מיקרו-מרית	פישר	S50821
צלחת תרבית 12 בארות	EMESCO	1194-353043
תנור	פישר	11-475-154
אינקובטור	פישר	13 998 076
מיקרוסקופ Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	משמש לצילום תמונות ניגודיות פאזה. עם רכישת תמונה דיגיטלית באמצעות מצלמת QiClick המתממשקת לתוכנת המחקר הבסיסית של Nikon elements (4.10.01).

כלים של