שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה ביולוגית במבחנה מודל. הגישה ניתן להשתמש עם חיידק כלשהו ניתנת לטווח ארוך ושיתוף תרבות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות
במאמר זה
סיכום
תקציר
Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) הם המדביקה בני אדם, חיידקים גראם שליליים, שעלולים לגרום לזיהומים חוזרים כרונית של רירית דרכי הנשימה 1, 2. כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם אורגניזמים אלה לשרוד על ובתוך הרקמות בדרכי הנשימה, מודל שבו מוצלח לטווח ארוך שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אדם יכול להתבצע נדרשת. אנו משתמשים העיקרי ברקמות אנושיות אפיתל הנשימה העלה לממשק אוויר נוזלי, מודל EpiAirway (MatTek, אשלנד, MA). אלה שאינם מונצחים היטב הבדיל, 3 מימדי רקמות שמכילות צמתים הדוקים, תאים ריסי ו nonciliated, תאים המייצרים הגביע mucin, ולשמר את היכולת לייצר ציטוקינים בתגובה לזיהום.
זה רלוונטי מבחינה ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית ניתן להשתמש במספר דרכים: המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לבצע לטווח ארוך ושיתוף תרבות של רקמות EpiAirway עם NTHi ו לכמת תא הקשורים חיידקים הפנימו לאורך זמן . כמו כן, הייצור mucin את הפרופיל של ציטוקינים הנגוע שיתוף תרבויות ניתן לקבוע. גישה זו משפר עם השיטות הקיימות כי פרוטוקולים רבים כיום להשתמש שקוע monolayer או Transwell תרבויות של תאים אנושיים, אשר אינם מסוגלים לתמוך זיהומים חיידקיים לאורך תקופות ממושכות 3. לדוגמה, אם אורגניזם יכול לשכפל בתקשורת שמעליה, זה יכול לגרום לרמות מקובלות של cytotoxicity ואובדן של תאים המארח, לעצור את הניסוי. המודל EpiAirway מאפשר אפיון של לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות. יתר על כן, מאז המקור EpiAirway הוא אדם נורמלי tracheo-הסימפונות תאים ולא קו הנציח, כל אחד הוא ייצוג מעולה של רקמה אנושית בפועל בדרכי הנשימה העליונות, הן במבנה והן פונקציה 4.
בשיטה זו, הרקמות EpiAirway הם להיגמל של תרכובות אנטי מיקרוביאליים ואנטי פטרייתי עבור 2 ימים לפני הלידה, וכל ההליכים מתבצעים תחת אנטיביוטיקה ללא תנאים. זה מחייב שיקולים מיוחדים, שכן הן חיידקים ברקמות אנושיות העיקרי משמשים בממשלה biosafety אותו דבר, הם שיתוף תרבותי במשך תקופות ממושכות.
פרוטוקול
1. הכנת ארון biosafety עבור הרקמות EpiAirway
- לבוש בחלוק מעבדה ייעודי, עם שיער אסוף וכפפות על, להתחיל את הזרימה למינרית. אחרי 5 דקות, להעביר כל הכלים בארון (pipettors, טיפים, מבחנות צנטריפוגה וכו ') לצד אחד, לרסס את פנים ארון biosafety ואת האבנט עם 70% אתנול ו - לנגב עם נייר סופג נקי. תרסיס לניקוי הפנים שוב עם אתנול 70% ולהשאיר לייבוש. הזזת כלים לצד נקי לחזור על התהליך אתנול.
- השתמשו בתרסיס פיפטה מחסום טיפים pipettors ייעודי בממשלה. כדי להשתמש בנפרד עטופה pipettes סרולוגיות סטרילי, להעביר את....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה זו מאפשרת את חקירת לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות רקע רלוונטי מבחינה ביולוגית העיקרי של רקמות הנשימה האנושית ממשק אוויר הנוזל. כאן השתמשנו NTHi כמו הדבקה של האורגניזם, אבל האינטראקציה של חיידק כלשהו שאינו מקובל להציג cytotoxicity לאורך זמן ניתן לכמת בשיטה זו. המודל EpiAirway יכול לשמש גם למחקר של וירוסים, תרופות, או חומרים כימיים המשפיעים על דרכי הנשימה העליונות האנושית 5, 6, 7, 8. שמרנו רקמות נגוע במשך יותר מ 40 ימים, רקמות נגועים NTHi במשך לפחות 10 ימים. אנו .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
ברצוננו להודות פטריק היידן (MatTek) לדיונים מועיל, ורוברט סמית ליבי פרי של גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטת מיומנויות EM שלהם. מחקר זה מומן על ידי מענק NIDCD DC010187 לאבא
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | קטלוג # | תגובות |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% ב D-PBS ללא סידן או מגנזיום, מסנן לעקר |
| 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים או בלי סידן ומגנזיום | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway אנטיביוטי ללא רקמות | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway אנטיביוטי ללא תחזוקה התקשורת | MatTek | AIR-100-MM-ABF | מסופק עם ערכת |
| פוספט שנאגרו 10X תמיסת מלח | EMD | 6506 | מדולל ל 1X לפני השימוש |
| לטין | JT בייקר | 2124-01 | הוסף בריכוז סופי של 0.1% ב 1 X PBS ו החיטוי |
| Difco GC מאגר בינוני (אגר שוקולד) | VWR | 90002-016 | החיטוי 36 גרם ב 500 מ"ל DDH 2 O קריר עד 60 ° צלזיוס |
| BBL המוגלובין (אגר שוקולד) | VWR | 90000-662 | החיטוי 10 גרם ב 500 מ"ל DDH 2 O, קריר עד 60 ° צלזיוס ומערבבים עם בסיס בינוני GC לעיל |
| BD BBL IsoVitaleX העשרה (אגר שוקולד) | VWR | 90000-414 | מצננים את התערובת על בסיס בינוני GC ו המוגלובין עד 55 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 מ"ל של IsoVitaleX rehydrated, יוצקים שוקולד צלחות אגר |
| מלקחיים הביתור, עצה טובה, מעוקל | VWR | 82027-406 | |
| עצמית איטום עיקור שקיות | VWR | 89140-802 | |
| סולפט גנטמיצין, 10 מ"ג / מ"ל | Lonza | 17-519Z | הוסף 10 מיקרוליטר / ml כדי MM EpiAirway עבור להרוג גנטמיצין |
מקורות
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
