שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

סיכום

שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה ביולוגית במבחנה מודל. הגישה ניתן להשתמש עם חיידק כלשהו ניתנת לטווח ארוך ושיתוף תרבות.

תקציר

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) הם המדביקה בני אדם, חיידקים גראם שליליים, שעלולים לגרום לזיהומים חוזרים כרונית של רירית דרכי הנשימה ^{1, 2.} כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם אורגניזמים אלה לשרוד על ובתוך הרקמות בדרכי הנשימה, מודל שבו מוצלח לטווח ארוך שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אדם יכול להתבצע נדרשת. אנו משתמשים העיקרי ברקמות אנושיות אפיתל הנשימה העלה לממשק אוויר נוזלי, מודל EpiAirway (MatTek, אשלנד, MA). אלה שאינם מונצחים היטב הבדיל, 3 מימדי רקמות שמכילות צמתים הדוקים, תאים ריסי ו nonciliated, תאים המייצרים הגביע mucin, ולשמר את היכולת לייצר ציטוקינים בתגובה לזיהום.

זה רלוונטי מבחינה ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית ניתן להשתמש במספר דרכים: המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לבצע לטווח ארוך ושיתוף תרבות של רקמות EpiAirway עם NTHi ו לכמת תא הקשורים חיידקים הפנימו לאורך זמן . כמו כן, הייצור mucin את הפרופיל של ציטוקינים הנגוע שיתוף תרבויות ניתן לקבוע. גישה זו משפר עם השיטות הקיימות כי פרוטוקולים רבים כיום להשתמש שקוע monolayer או Transwell תרבויות של תאים אנושיים, אשר אינם מסוגלים לתמוך זיהומים חיידקיים לאורך תקופות ממושכות ^3. לדוגמה, אם אורגניזם יכול לשכפל בתקשורת שמעליה, זה יכול לגרום לרמות מקובלות של cytotoxicity ואובדן של תאים המארח, לעצור את הניסוי. המודל EpiAirway מאפשר אפיון של לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות. יתר על כן, מאז המקור EpiAirway הוא אדם נורמלי tracheo-הסימפונות תאים ולא קו הנציח, כל אחד הוא ייצוג מעולה של רקמה אנושית בפועל בדרכי הנשימה העליונות, הן במבנה והן פונקציה ^4.

בשיטה זו, הרקמות EpiAirway הם להיגמל של תרכובות אנטי מיקרוביאליים ואנטי פטרייתי עבור 2 ימים לפני הלידה, וכל ההליכים מתבצעים תחת אנטיביוטיקה ללא תנאים. זה מחייב שיקולים מיוחדים, שכן הן חיידקים ברקמות אנושיות העיקרי משמשים בממשלה biosafety אותו דבר, הם שיתוף תרבותי במשך תקופות ממושכות.

פרוטוקול

1. הכנת ארון biosafety עבור הרקמות EpiAirway

1. לבוש בחלוק מעבדה ייעודי, עם שיער אסוף וכפפות על, להתחיל את הזרימה למינרית. אחרי 5 דקות, להעביר כל הכלים בארון (pipettors, טיפים, מבחנות צנטריפוגה וכו ') לצד אחד, לרסס את פנים ארון biosafety ואת האבנט עם 70% אתנול ו - לנגב עם נייר סופג נקי. תרסיס לניקוי הפנים שוב עם אתנול 70% ולהשאיר לייבוש. הזזת כלים לצד נקי לחזור על התהליך אתנול.
2. השתמשו בתרסיס פיפטה מחסום טיפים pipettors ייעודי בממשלה. כדי להשתמש בנפרד עטופה pipettes סרולוגיות סטרילי, להעביר את סוף מחובר דרך הזרימה למינרית, לפרוץ, והחלק את פיפטה לתוך ארון, משיל מחוץ לאריזה.
3. מוסיף EpiAirway חייבים להיות מטופלים עם מלקחיים סטרילית. מקום 6 אינץ' קצה עדין מעוקל לנתח מלקחיים לתוך עצמית איטום שקיות העיקור החיטוי. הכינו מספיק כדי לקבל לפחות שישה ליום מוכן לשימוש.

2. לפרוק את הרקמות EpiAirway

1. ריסוס משטח עבודה הקבינט biosafety עם 70% אתנול ו - לנגב עם נייר סופג נקי. תרסיס שוב לאפשר למשטח להתייבש לפני השימוש. פתח את תיבת EpiAirway ולהיפטר קלקר וחומרי אריזה.
2. אנטיביוטיקה ללא EpiAirway תחזוקה התקשורת, AIR-100-MM ABF (MM), היא קניינית MatTek ונשלח בערכה עם מוסיף את. בשנת הקבינט biosafety, תווית six סטרילי 50 צנטריפוגות צינורות מ"ל עם סוג התקשורת התאריך, לשחרר את כובעי. תרסיס בבקבוק התקשורת עם 70% אתנול ו פתוח בתוך הממשלה. Aliquot 25 מ"ל של MM לתוך צינור אחד בעזרת פיפטה חדש סרולוגיות סטרילי עבור כל צינור, להדק את כובעי, ולאחסן ב 4 ° C. השתמש aliquot טריים של MM בכל יום.
3. חזור על 2.2 לעיל באמצעות בקבוק חדש של 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) עם סידן ומגנזיום. חזור שוב באמצעות D-PBS ללא סידן ומגנזיום. אחסן את כל aliquots ב 4 ° C.
4. מוסיף EpiAirway AIR-100 מגיעה צלחת 24 גם בבית 4 ° C על התקשורת המכילים מוצק agarose, ויש להציב לתוך 6 צלחות טוב לשימוש. לייבל כל צלחת עם התאריך ותיאור באמצעות סמן אתנול עמידים. מקום 1 למיליליטר של MM 4 מעלות צלזיוס EpiAirway לבאר כל אחד. הסר את צלחת תחבורה מאריזתו, תרסיס עם אתנול 70%, ואת המקום בממשלה biosafety. הסר את הסרט ולפתוח את הצלחת. בעזרת מלקחיים autoclaved, להסיר את גזה לח במשך מוסיף EpiAirway.
5. תרימי להכניס עם מלקחיים autoclaved בתנועות פיתול לסייע בשחרור זה מן agarose, ואת המקום לבאר צלחת 6 באר. Agarose חלקם עשויים לדבוק להכניס את, במיוחד את הטמפרטורה של צלחת התחבורה מגביר את הסביבה. השתמש צמר גפן סטרילי עד בזהירות להסיר את agarose מ להכניס את. הימנע מנגיעה הממברנה, ולבדוק שאין בועות אוויר לכודות מתחת מוסיף את. מניחים את הצלחת לתוך humidified 37 ° C חממה עם 5% CO _2.
6. אפשר לפחות 24 שעות הרקמות לאזן בחממה לפני תחילת שיתוף תרבויות.

3. תחזוקה של רקמות EpiAirway

1. בעזרת מלקחיים autoclaved, להרים בעדינות להכניס פיפטה 200 מיקרוליטר של טרום חימם D-PBS עם סידן ומגנזיום על רקמות ועל הסלע להוסיף. הטה את הכנס בזווית ומקום קצה פיפטה סטרילית שלך P1000 נגד טבעת הפלסטיק שמחזיק את קרום בתחתית להכניס את. אל תיגע רקמות. לשאוב D-PBS לשטוף את המקום cryovial סטרילית שכותרתו. דוגמאות אפשר להקפיא ב -20 ° C ו assayed עבור mucin ו / או ביטוי ציטוקינים במועד מאוחר יותר.
2. שינוי יומי על ידי MM הבסיס aspirating והחלפת עם למיליליטר 1 של MM צח. השתמש טיפ חדש פיפטה מכשול גם עבור כל אחד. פנקו את התקשורת בשימוש עם אקונומיקה 10% לילה וזורקים.

4. הרכבה של רקמות EpiAirway

1. Streak את תרבות חדשה של nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) ממלאי גליצרול קפוא על אגר שוקולד. לגדול לילה humidified 5% CO ₂ באינקובטור.
2. למחרת, resuspend מושבות אחת NTHi מראש חימם D-PBS עם סידן ומגנזיום כדי OD (600 ננומטר) של כ 0.7. וורטקס במרץ לפני מדידת צפיפות אופטית. מערכת היחסים של צפיפות אופטית למושבה יוצרי יחידות מ"ל (CFU / ml) של NTHi היא OD (600 ננומטר) של כ 0.2 שווה 1.0 x 10 ⁸ CFU / ml. לכן, OD (600 ננומטר) של 0.7 כ 3.5 x 10 ⁸ CFU / ml. אלגוריתם זה אמור להיות מאומת עבור כל זן NTHi לפני חיסון.
3. רקמות EpiAirway AIR-100 מגדלים על מוסיף עם פני שטח של 0.6 ס"מ ² ו קרום 0.4 מיקרון. רקמות מורכבות ~ 8.0 x 10 ^-5 ~ 1.0 x 10 ^{6 <}/ Sup התאים>. לכן, הרכבה של 1.0 x 10 ⁷ CFU מתאים ריבוי של זיהום של כ - 10-12. כדי לחסן, ולשטוף כל להכניס EpiAirway כמו 3.1, ולאחר מכן להוסיף 28 מיקרוליטר של ההשעיה חיידקי שהוכנו 4.2 אל פני השטח של apical להכניס כל EpiAirway בממשלה biosafety. אין לחסן MM הבסיס. חזור לכל צלחת אל האינקובטור.

5. כימות של inoculum NTHi

1. הכן בופר פוספט (PBS) פתרון עם 0.1% החיטוי ג'לטין, (PBS-G) לעקר. סטרילי לייבל 1.5 מ"ל Eppendorf צינורות עם דילולים 1:10 הרצויה על בסיס OD (600 ננומטר) של inoculum ו aliquot 900 מיקרוליטר של סטרילית PBS-G לתוך צינור אחד.
2. לקבוע את מספר צלחות אגר שוקולד נדרש למנות את NTHi מחוסן. מקום אלו הצלחות באינקובטור באוויר במהופך עם בתחתית הצלחת מונחת על חצי העליון במשך שעה אחת. זה יאפשר את הצלחת לשני חמים 37 ° C ו משטח יבש, להקל את הירידה-ציפוי של NTHi.
3. הפעל את דילולים 1:10 הסידורי של inoculum על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של ההשעיה חיידקי מ -4.2 ל הצינור הראשון. וורטקס דילול כל נמרצות במשך 5 שניות לפני ביצוע הבא. Drop 10 aliquots microliter על גבי צלחות אגר מראש חימם משטח יבש שוקולד, תוך שימוש במחצית צלחת עבור כל דילול. חמישה עד שישה 10 aliquots microliter יכול להתאים על חצי אחד של כל צלחת 100 מ"מ בלי לרוץ יחד. כאשר המקום יבש, במהופך humidified 37 ° C-CO ₂ באינקובטור במשך הלילה.
4. למחרת, לקבוע את CFU / ml על ידי ספירת דילולים כי יש 15-30 מושבות נפרדות טיפה כל חישוב חזרה inoculum קיימא בפועל של NTHi.

6. לטווח ארוך ושיתוף תרבות עם NTHi

1. כל 24 שעות, לשטוף את מוסיף כמו 3.1, אז הבריכה כביסות של כל רקמות כי כבר מחוסן עם זן זהה של חיידקים להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס cryovial שכותרתה לצורך ניתוח עתידי. דגימות אלה יכולים להיות assayed נוכחות של mucin ידי כתמים נקודה או ביטוי של ציטוקינים על ידי ELISA. לחלופין, רקמות ניתן לקצור את ה-mRNA ו qPCR יכול להתבצע על הגנים של עניין. שינוי יומי MM הבסיס כמו 3.2. המשך למשך התרבות המשותפת.

7. קציר של רקמות EpiAirway

1. הכן פתרון 1% טרי saponin ב D-PBS ללא סידן ומגנזיום, מסנן לעקר וחם עד 37 ° C.
2. חם שפופרת 50 מ"ל של MM ועוד של D-PBS ללא סידן ומגנזיום עד 37 ° C.
3. הכן צינורות דילול כמו 5.1, כמו גם אחד ריק סטרילי 1.5 מ"ל צינור Eppendorf לכל הכנס, שכותרתו עם מספר להוסיף מתח NTHi.
4. EpiAirways ניתן לקצור גם עבור תאים הקשורים חיידקים הכולל, הכולל הן אורגניזמים חסיד והפנימו, או חיידקים הפנימו בלבד.
5. לקבוע את מספר צלחות אגר שוקולד צריך טיפה צלחת התא הקשורים או פלשו NTHi, תווית ויבש למשך שעה אחת באינקובטור אוויר כמו 5.2.
6. כדי לקצור הכולל תאים הקשורים חיידקים, לשטוף את פני השטח של apical EpiAirways שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום, ואז להטות את הכנס ולשטוף MM כל שנותר קרום הבסיס. לרחוץ את הראשון אפשר להקפיא לניתוח מאוחר יותר; להשליך שוטף הבאה.
7. מניחים את הכנס לרחוץ צלחת 6-היטב טריים ללא מ"מ, פיפטה 250 מיקרוליטר של פתרון סטרילי saponin 1% לעומת 7.1 apical על פני השטח של כל רקמות. חזור אל בחממה במשך 10 דקות.
8. הסר מן האינקובטור, ושימוש טיפ סטרילי P1000 פיפטה, לשפשף את הרקמות של הממברנה באמצעות גב ו-תנועה קדימה, ואחריו בתנועה מעגלית כדי להסיר את הרקמות מקצות להכניס את. שימוש גדול נשא קצה פיפטה סטרילית P1000, המקום ההשעיה לתוך הצינור שכותרתו ריק שהוכנו 7.3. הוסף 250 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום על פני השטח של apical להכניס את.
9. בדוק את הכנס באמצעות מיקרוסקופ הפוכה שלב בניגוד לקבוע אם יש רקמה הנותרים להיות שנקטפו. במידת הצורך, לשפשף שוב עם טיפ נוסף P1000 פיפטה סטרילית, ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה על הצינור של 7.8 שימוש גדול נשא קצה פיפטה סטרילית P1000. תביאו את הנפח הכולל של הצינור אל למיליליטר 1 באמצעות D-PBS ללא סידן או מגנזיום.
10. מערבולת במרץ ההשעיה התא במהירות שיא במשך דקה אחת. באמצעות מזרק 1 מ"ל סטרילי מצויד במחט 26 מד, לשאוב את ההשעיה לתוך המזרק דרך המחט. לאט לאט להעביר את ההשעיה דרך 3 פעמים מחט, נזהרת שלא ליצור בועות. וורטקס במרץ שוב למשך דקה אחת.
11. בעזרת טיפ גדול נשא פיפטה, במקום 100 מיקרוליטר של ההשעיה לתוך הצינור דילול הראשון הכין ב -7.3. וורטקס בתוקף למשך חמש שניות, ולאחר מכן לבצע דילולים 1:10 סדרתי. Drop-הצלחת דילולים הרצוי על גבי משטח יבש צלחות אגר שוקולד.
12. כדי לקצור חיידקים הפנימו בלבד, לשטוף את כל להכניס 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום. לשמר להקפיא את לשטוף הראשון. הוסף סולפט גנטמיצין מ"מ מראש חימם לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל. הכן 1.5 מ"ל של התקשורת לכל להכניס להיות שנקטפו. החלף את הבסיס עם MM MM גנטמיצין המכילים, ולהוסיף 300 מיקרוליטר של MM גנטמיצין המכילים על פני השטח apical. מניחים את הצלחת בחזרה CO ₂ באינקובטור במשך שעה אחת.
13. הסר את MM גנטמיצין המכילים מפני השטח apical לשטוף את פני השטח apical ואת קרום הבסיס של להכניס את נרחב עם טרום חימם D-PBS ללא סידן ומגנזיום. המשך כמו 7.7-7.11.

8. נציג התוצאות:

סריקה micrographs אלקטרונים של רקמות (א ') EpiAirway נגוע ו (ב) רקמות אחרי תרבות משותפת של 5 ימים עם NTHi מוצגים באיור 1. לטווח ארוך ושיתוף תרבות עם NTHi לא לגרום נזק משמעותי apical ברקמות, דבר המלמד על התועלת של המודל EpiAirway. גרף המתאר את מספר החיידקים הפנימו לכמת לאורך זמן בתוך רקמות מוצג באיור 2. התוצאות שניהם לשחזור למדי, מה שהופך את הרקמות EpiAirway עקבי ורלוונטי ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית שבה ללמוד NTHi מארח הפתוגן אינטראקציות.

באיור 1. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים של רקמות EpiAirway. א בקרה רקמות נגוע. ב רקמות לאחר חמישה ימים של תרבות משותפת עם NTHi. נזק לא משמעותי על פני השטח apical הוא ציין ברקמות נגועות.

איור 2. מספר NTHi הפנימו לאורך זמן במהלך התרבות שיתוף EpiAirway. מסננים R2866 היה מחוסן על כ 1.0 x 10 ⁷ CFU / להוסיף (יום 0), שנקטפו ואז לחיידקים הפנימו בכל נקודת זמן המצוין. ברים לייצג n = 3 משכפל לפחות כפולים. ברים שגיאה הם SD.

דיון

שיטה זו מאפשרת את חקירת לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות רקע רלוונטי מבחינה ביולוגית העיקרי של רקמות הנשימה האנושית ממשק אוויר הנוזל. כאן השתמשנו NTHi כמו הדבקה של האורגניזם, אבל האינטראקציה של חיידק כלשהו שאינו מקובל להציג cytotoxicity לאורך זמן ניתן לכמת בשיטה זו. המודל EpiAirway יכול לשמש גם למחקר של וירוסים, תרופות, או חומרים כימיים המשפיעים על דרכי הנשימה העליונות האנושית ^{5, 6, 7, 8.} שמרנו רקמות נגוע במשך יותר מ 40 ימים, רקמות נגועים NTHi במשך לפחות 10 ימים. אנו ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	קטלוג #	תגובות
Saponin	Calbiochem	558255-25GM	1% ב D-PBS ללא סידן או מגנזיום, מסנן לעקר
1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום	Lonza	17-513Q
1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים או בלי סידן ומגנזיום	Lonza	17-515Q
EpiAirway אנטיביוטי ללא רקמות	MatTek	AIR-100-ABF
EpiAirway אנטיביוטי ללא תחזוקה התקשורת	MatTek	AIR-100-MM-ABF	מסופק עם ערכת
פוספט שנאגרו 10X תמיסת מלח	EMD	6506	מדולל ל 1X לפני השימוש
לטין	JT בייקר	2124-01	הוסף בריכוז סופי של 0.1% ב 1 X PBS ו החיטוי
Difco GC מאגר בינוני (אגר שוקולד)	VWR	90002-016	החיטוי 36 גרם ב 500 מ"ל DDH 2 O קריר עד 60 ° צלזיוס
BBL המוגלובין (אגר שוקולד)	VWR	90000-662	החיטוי 10 גרם ב 500 מ"ל DDH 2 O, קריר עד 60 ° צלזיוס ומערבבים עם בסיס בינוני GC לעיל
BD BBL IsoVitaleX העשרה (אגר שוקולד)	VWR	90000-414	מצננים את התערובת על בסיס בינוני GC ו המוגלובין עד 55 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 מ"ל של IsoVitaleX rehydrated, יוצקים שוקולד צלחות אגר
מלקחיים הביתור, עצה טובה, מעוקל	VWR	82027-406
עצמית איטום עיקור שקיות	VWR	89140-802
סולפט גנטמיצין, 10 מ"ג / מ"ל	Lonza	17-519Z	הוסף 10 מיקרוליטר / ml כדי MM EpiAirway עבור להרוג גנטמיצין