Culturing ו Electrophysiology של תאים על Patch-clamp צ'יפס NRCC

סיכום

אנחנו מראים איך מישורי תיקון, מהדק שבבי מפוברק המועצה הלאומית למחקר של קנדה מעוקרים, דרוך, עמוסה בינונית, מצופה בתאים, ושימשו הקלטות אלקטרו.

תקציר

בשל הרגישות המעודן שלה ואת היכולת לפקח ולשלוט תאים בודדים ברמה של תעלות יונים, תיקון, הוא מהדק את תקן הזהב של electrophysiology ליישם מודלים מחלות ומסכי התרופות כאחד ^1. השיטה המסורתית כוללת בעדינות ליצור קשר סלולרי עם טפטפת זכוכית מלאה של פתרון פיזיולוגי כדי לבודד את תיקון של קרום מתחת לשיאה ^2. האלקטרודה הוכנס פיפטה לוכד יונים ערוצים הפעילות תוך תיקון קרום או, כאשר מקרע, לתא כולו. בעשור האחרון, תיקון, מהדק שבבי הוצעו גם חלופה ^{3, 4:} הסרט הושעה מפריד בינוני פיזיולוגי ממדיום תרבות, צמצם microfabricated בסרט מחליף את שיאו של טפטפת. Patch-clamp שבבי השתלבו במערכות אוטומטיות ממוסחרים לסינון תפוקה גבוהה ^5. כדי incrלהקל על התפוקה, הם כוללים משלוח fluidic של תאים מן ההשעיה, המיקום שלהם על הפתח על ידי שאיבה, ואת השגרה אוטומטיות לגילוי תאים ל-בדיקה חותמות ולהיכנס למצב התא כולו. יש לנו דיווח על ייצור של שבב סיליקון תיקון, מלחציים עם עכבה אופטימיזציה צורת פתח המאפשר הקלטה באיכות גבוהה של פוטנציאל פעולה של נוירונים בתרבית ⁶ חלזונות, לאחרונה, דיווחנו גם התקדמות לקראת לחקור נוירונים יונקים ^7. שבבי תיקון, מהדק שלנו מיוצרים על הקנדי Photonics ייצור מרכז ^8, היציקה מסחרי, והם זמינים בסדרה גדולה. נשמח לקיים שיתופי פעולה עם electrophysiologists כדי לאמת את השימוש בטכנולוגיה NRCC במודלים שונים. השבבים משמשים על פי התוכנית הכללית מיוצג באיור 1: שבב סיליקון היא בחלק התחתון של בקבוקון תרבות הפרספקס האחורי של הצמצם מחובר chann תת קרקעיאל מצויד עם צינורות בכל צד של החבילה. תאים בתרבית בבקבוקון ושל התא על גבי החללית מנוטר על ידי אלקטרודה המדידה מוכנס 2 channel.The מחוץ יציאות fluidic להקל על חילופי פתרון עם הפרעה מינימלית לתא, זה יתרון לעומת בטפי להחדרת נוזלים זכוכית עבור תאיים זלוף.

באיור 1. עקרון המדידה באמצעות שבב NRCC תיקון, מהדק

אנחנו כאן בפירוט את הפרוטוקולים כדי לעקר וראש צ 'יפס, לטעון אותם עם צלחת בינונית, אותם תאים, ולבסוף להשתמש בהם הקלטות אלקטרו.

פרוטוקול

1. ייצור שבב

התהליך המתואר ⁶ תוצאות הסרט 3 מיקרומטר עצמי עומד עבה, התנגדות נמוכה 1 גישה Mohm ואת חלקה על פני השטח בצורת משפך צמצם המאפשר חותם אינטימי עם תא ^9, ראה איור 2. השבבים הם singulated והדביק בחבילות פרספקס עם צמצם מול חור חיבור שבבים ערוץ תת קרקעי. הדבקה היא לוותר באופן שימזער את קיבול המחלף כדי pF 17 הנומינלי. חבילות מצוידים בקוטר 1.5 2 מ"מ ו 6 מ"מ צינורות זכוכית ארוכים כמו יציאות fluidic (איור 3).

איור 2. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של סעיף יון קרן ממוקדת של שבב תיקון, מלחציים NRCC מראה סיליקון חלקה דו פני השטח בצורת משפך כי מעדיף קשרים אינטימיים סלולריים, ו פתח רדודה מהווה resistanc גישה נמוךה.

איור 3. שבב מודבק בחלק התחתון של בקבוקון תרבות בחבילה פרספקס מצויד fluidics תת קרקעיים וצינורות זכוכית.

2. , עיקור תחול ובדיקה

השלבים הבאים יש לבצע בארון בטיחות ביולוגיה, כדי למנוע זיהום או חיבור של זמן.

• לעקר שבבי ב נקי בסיסי פלזמה Harrick (www.harrickplasma.com) עם לחץ אוויר mbar 0.1-0.3 שיורית במשך 15 דקות בהספק מקסימלי של 18 וו מערכות אוויר אחרים הפלזמה ניתן להשתמש, עם צפיפות הספק דומה (24 mW / cm ³⁾ ושמירה על תוצר של צפיפות הספק וזמן קבוע. טיפול פלזמה גם הופך את שבבי הידרופילי, המאפשר תחול.
• התאמה צינורות זכוכית עם סטרילית צינורות סיליקון Silastic מעבדה, 1 מ"מ X 2 מ"מ מזהה OD (קול בן הזוגהחתול. # 96115-08), 3inch מצד אחד, 1 אינץ' בצד השני.
• מלא fluidics דרך צינורות עם פתרון סינון סטרילי פוספט מאגר סטנדרטית (PBS), כדי לוודא שאין בועה לכודה.
• קליפ צינורית סיליקון ארוכה pressurizing PBS מצד קצר כספומט 1. מאגר של PBS מחלחל דרך פתח יהיה גלוי בבקבוקון. קליפ אספקת בלחץ של PBS ולנתק את שפופרת סיליקון קצר אספקה.
• מלא בקבוקון עם סינון PBS באמצעות מזרק.
• לטבול Ag / Ag: אלקטרודה Cl בצינור קצר נגד האלקטרודה בבקבוקון. מטר עכבה משמש כדי לאשר את ההתנגדות הגישה היא בין 300kohm ו 3Mohm ואת קיבול המחלף הוא בין 10pF ו 25pF. שבב עם התנגדות נמוכה יותר עלולה להיות דליפה, ואת קיבול גבוה יותר נחשב לא ראוי לשימוש כפי שהוא לא יכול ללכוד את הדינמיקה המהירה של electrophysiology תא של ^6. שבב עם קיבול נמוךאו התנגדות גבוהה יותר נחשב מחובר, אם כי זה יכול להיות פשוט בועה לכוד פתח. שבבי חלק מחדש נבדק לאחר 1H ונמצא יש עכבה הנכון אלקטרוכימי.
• לשטוף עם מים fluidic ערוץ deionized סטרילית, לרוקן את המכל העליון ולשטוף עם זאת, פעמיים.
• לטבול את השבב ארוז עם צינורות מים מתוקים deionized סטרילית של 30 דקות ולאחר מכן לטעון עם שבבים אחרים במיכל סטרילי מלא מים deionized סטרילית. הדבר מבטיח כי שבבי להישאר הידרופילי ומוגן מפני זיהום.

3. שבבי הכנה במעבדה ביולוגיה של התא

השלבים הבאים מתבצעים מכסה המנוע למינרית HEPA מסונן זרימת שימוש בטכניקות אספטיים, כל פתרונות המשמשים בהליך זה חייב להיות מסונן עיקור לפני השימוש באמצעות מסנן 0.22μm.

• פתח מיכל שבב מתחת למכסה המנוע זרימת HEPA מסונן למינרית ולהסיר שבבי מ container עם הפנים כלפי מטה, כדי למנוע הצפות גורף מזהמים אפשריים לתוך בקבוקון העליון.
• יש לשטוף גבי בקבוקון של 2x שבב עם מים מסוננים טריים deionized סטרילי להסיר שאריות הפסולת מפני השטח השבב.
• לשאוב מים deionized סטרילית את הבקבוקון העליון.
• חבר קצה אחד של צינור silastic מחובר לערוץ fluidic כדי מזרק בלחץ המכיל מים סטריליים deionized מסוננים. במערכת שלנו, מזרקים מלאים פתרון הם בלחץ על ידי חיבור מיכל אוויר דחוס מוגדר 20psi. על מנת להבטיח סטריליות, אוויר מסונן (0.22 מיקרומטר מסנן) לפני הכניסה לתוך המזרק והמערכת שלנו יש גם שסתום on / off, המאפשר לנו לעצור או להפעיל לחץ בעת הצורך.
• שימוש hemostat, להדק את סוף הפלט של צינורות.
• פתח on / off שסתומים בכדי לשמור על לחץ פתרון.
• לשטוף fluidic subterranen של השבב עם מים טריים deionized סטרילית, unclamp בסוף הפלט של צינורות.
• אל עלCE מים דרך הפתח, להדק את סוף הפלט של צינורות עם hemostat.
• כדי למנוע ניקוז מים מהדק קלט פלט קצות צינורות עם hemostats כ ולסגור on / off שסתומים.
• לנתק את סוף הקלט של צינורות מן המזרק.
• הכנס פקקי זכוכית לתוך בשני הקצוות של הצינור ולהסיר את hemostats.
• מלא בקבוקון העליון במים steriled מסנן deionized.
• מניחים את המכסה של צלחת סטרילית 35 מ"מ לבסיס של צלחת סטרילי 100 מ"מ
• במקום שבב על גבי מכסה 35 מ"מ ומכסים במכסה 100 מ"מ צלחת.
• שבבי תמונה על מנת להבטיח כי הממברנה צמצם של שבבים הם ללא פסולת ו / או בועות אוויר. במעבדה שלנו אנו משתמשים במיקרוסקופ זקוף 20x למרחקים ארוכים במטרה לעבוד.
• אם ופסולת / או בועות אוויר נוכחים, שוב ושוב לרוקן ערוץ fluidic ו בקבוקון העליון. אם פסולת ו / או בועות אוויר לא ניתן להסיר את השבב נמחק.
• לאחר שבבי הםהדמיה, חזור אל מכסה המנוע זרימה למינרית ונתק את שני הקצוות של צינור.
• צרף קצה אחד של צינור כדי מזרק המכיל בלחץ התקשורת פיזיולוגיים.
• הצמד בסוף הפלט של צינורות עם hemostat
• פתיחת שסתום לחץ, להסיר את hemostat מסוף פלט של fluidics את ולשטוף את ערוץ התקשורת עם fluidic פיזיולוגיים
• לשטוף fluidic תת קרקעי עם התקשורת פיזיולוגיים, פתח on / off שסתומים ולהסיר hemostat מסוף פלט של צינורות.
• כדי לאלץ את התקשורת פיזיולוגיים דרך זמן, להדק את סוף הפלט של צינורות עם hemostat.
• הצמד בסוף הקלט של צינורות עם hemostat ולסגור on / off שסתומים.
• הסר את הקצה של צינור הזנה מן המזרק וחבר את שני הקצוות של צינור עם אטמי גלאס.
• הסר את hemostats.
• הסר את המים בקבוקון העליון.
• למלא את הבקבוקון העליון עם מסנן התקשורת פיזיולוגיים מעוקרות.
• מניחים את השבב בחזרה לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ.
• מניחים את בסיס של צלחת 35 מ"מ לתוך צלחת 100 מ"מ ולמלא את זה עם מסנן מים deionized עיקור להעשיר לחות.
• לכסות את התבשיל עד שהגיע הזמן ציפוי

4. ציפוי התא של הנוירונים השבלול

את התיקון, מהדק שבבי מתאים לכל מגוון רחב של הכנות. כרגע אנחנו בודקים שבבים שלנו יונקים נוירונים בקליפת המוח יסודי השיגו תוצאות ראשוניות עם תאים בתרבית למשך 14 יום ^7, המציינת כי פרוטוקול עיקור שלנו היא נאותה וכי שבבי אינם ציטוטוקסיות לטווח ארוך תרבויות. לצורך הפרוטוקול, הנוירונים השבלול נבחרו משום שהם מייצגים מודל פשוט, אך מבוססת היטב ללמוד electrophysiology העצבית ^11, וזה עם תאים אלה, כי השגנו את התוצאות המשמעותיות ביותר עד כה ^10. בידוד תא מפורט ונהלי תרבות ישתוארו בעבר ^{12, 13.}

• להסיר את הקליפה החיצונית 2-3 stagnalis בן חודש Lymnaea עם מלקחיים קהים ובעלי חיים להרדים ב Lymnaea מלוחים המכילים ליסטרין 10%.

  כל הצעדים הבאים בסביבה נקייה מחיידקים בתוך מכסה המנוע זרימת אוויר למינרית עם ציוד לנתיחה פתרונות עיקור בטמפרטורת החדר.

• החלף התקשורת פיזיולוגיים ב fluidics את פתרון ההקלטה המתאים באמצעות פיפטה Eppendorf. במקרה של נוירונים Lymnaea פתרון כולל (מ"מ): 50 KCl, 5 MgCl _2, 5 ethylenebis (oxyethylenenitrilo) חומצה tetraacetic (EGTA) ו 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, pH 7.4 ; 130 mOsm) ¹⁴
• להצמיד את החלזונות לצלוחית Sylgard מלא Lymnaea מלוחים ולהסיר המוח כולו כפי שתואר קודם לכן ¹³
• לטיפול isolatאד המוח בתקשורת מוגדרים (DM) עם האנזים טריפסין (פתרון 0.2%, Sigma, קטלוג # T-9201) במשך 18 דקות ואחריו טיפול ב DM ו מעכב טריפסין (Sigma, סויה, קטלוג # T-9003) במשך 15 דקות.
• להצמיד את המוח לתוך צלחת Sylgard קטן מלא osmolarity גבוה מוגדר התקשורת (HODM - DM עם סוכר הוסיף: 750 μL של פתרון גלוקוז 1M עד 20 מ"ל DM).
• באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים ניתוח שלאחר המוות, להסיר את המעטה החיצוני והפנימי של הגרעינים של עניין, החשיפה הזו של נוירונים.
• באמצעות זכוכית מלוטשת אש פיפטה מלא HODM ומצורפת microsyringe, להחיל שאיבה עדינה ליד התא של עניין (השמאל הגב דוושת 1) עד נוירון מתנתק מהמוח, והוא תלוי פיפטה.
• פיפטה מזכוכית הוא עבר אז טבל neurochips בודדים שם עדין גירוש מן microsyringe מאפשר נוירונים כדי לדחוף בעדינות מתוך פיפטה והניח על גבי חורים תיקון הפרט על השבבים.
• אפשר התאים לשבת באין מפריע למשך תקופה מינימלית של 2h בטמפרטורת החדר כדי לקדם את הקשר שלהם אל פני השבב המקיף את הצמצם.

5. אלקטרו הקלטות

כדי לחבר את שבבי למגבר (במקרה שלנו מגבר 700B Multiclamp, התקנים מולקולריים, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)

• להחליף את פתרון fluidic תת קרקעית ו בבקבוקון שבב עם פתרונות הקלטה המתאימים. במקרה של נוירונים Lymnaea, לתאי תרבות העליונות מלאים Lymnaea מלוחים (מ"מ: 51.3 NaCl, KCl 1.7, 4 CaCl2, ו -1.5 MgCl2) שנאגרו ל-pH 7.9 עם HEPES ^14.
• ליציבות, שבב דבק לשקופית כוס ומניחים אותו מתחת למיקרוסקופ.
• כדי לחבר את השבב למגבר (במקרה שלנו מגבר 700B Multiclamp, התקנים מולקולריים, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב), חותכים קצה אחד של צינור ולהכניס silveחוט R המחובר הבמה בראש.
• מניחים את האלקטרודה התייחסות בבקבוקון גבי השבב.
• שבב מוכן כעת ההקלטה.
• החל שלב 5 mV עם מגבר למדוד התנגדות מוחלטת (R _T) ולקבוע את התצורה של הנוירונים: תאים המצורפת (R _t> 1 GΩ); התא כולו (RT = 50-100 הארעיים MΩ בתוספת קיבולי, מעיד קרע של קרום על הצמצם) או לא חותם (R _t <5 MΩ). במערכה האחרונה של ניסויים ¹⁰ לעומת 58% של תאים לו עמידות גבוהה החותמות, מתוכם, 80% של תאים הראה התגובות הנרגשות.

6. נציג תוצאות

• החל depolarizing פולסים הנוכחי (20 תוספת הרשות הפלסטינית) אל תא עצב (במקרה זה LPeD1).
• החזק את תא עצב ב כג קרוב לפוטנציאל המנוחה שלו (~ - 60 mV).
• לראות את התגובות האלה פולסים depolarizing. פעולה פוטנציאלים מעל הגבול צריךניתן לצפות, אם עצב הוא בר קיימא.
• איור 4 מראה תוצאה נציג אשר דנו בפרטים של ^{14, 15.}

באיור 4. מתח תגובות (למעלה) של תא עצב LPeD1 לסדרה מדורג של פולסים הנוכחית תאיים (להלן). פולסים הנוכחית יושמו ב כג = - 60mV.

פתרון בעיות

• לפני ציפוי, שבבי תמונה כדי לקבוע אם הממברנה צמצם הן ללא פסולת מתאים ציפוי. אנו משתמשים במיקרוסקופ זקוף 20x למרחקים ארוכים במטרה לעבוד. במערכה האחרונה של ניסויים ^1, 67% אחוזים של צ 'יפס היו טעונים בהצלחה באופן זה.
• אם ופסולת / או בועות אוויר נמצאים לבטל שבב ולנסות עוד אחד.
• בציפויי שונים (פלזמה) או ציפויים (PDL, PEI וכו ') ניתן ניסה, אבל ההצלחה יכולה להיות תלויה מאוד בסוג התאבשימוש.
• הרכב הפתרון fluidic ("פיפטה") ב קריטי ליצירת גיגה, החותם את התא כולו. התאם פתרון, לשים לב pH osmolarity, ואיפור יוניים.
• לתרבות לטווח ארוך יותר, להתחיל עם התקשורת בערוץ microfluidic, ולאחר מכן לעבור פיפטה פתרון לפני ההקלטה באמצעות טפטוף עדין הכבידה הפד (~ 0.5 mL / min).

דיון

תיקון-clamp של NRCC החקירה פלטפורמת השבבים הוא כלי רב עוצמה פוטנציאלי גבוהה מבחני תוכן ומידע התרופות לחקור במודלים חוץ גופית של המחלה. יתרונות לעומת בטפי להחדרת נוזלים זכוכית הם התנגדות גישה נמוכה, המהווה יתרון לחקור תאים גדולים, ולמרות קיבול מעט יותר תגרום דינמיקה דומה של תאים קטנים יותר. תא ספונטנית חותמות צוהר התקבלו באופן שגרתי, והכניסה לתא כולו נצפתה להיות ספונטנית ^14. הבדל ברור בין שבבי ואת שיטת פיפטה זכוכית היא העובדה כי בדיקה הוא חלק מנה תרבית תאים ולא מובא באופן ידני במגע עם קרום התא. Culturing תאים, אולי חלק של רשתות פונקציונליות, התוצאות במודלים רלוונטיים מבחינה ביולוגית יותר כמודלים מחלות, מנגנון שונה לאבטחת התא גבוהה לחקור כלבי ים ^16. עם זאת, בניגוד השעיות סלולריים, השאיפה cannoלא ניתן להשתמש כדי למקם את התא על החללית. נוירונים חילזון, כמו תאים גדולים אחרים, ניתנים המיקום ידנית על גבי החללית. עבור תאים קטנים הדורשים פעמים תרבות ארוכות יותר, יש לנו חסכה מניפולציה כלשהי ולשמור על הסתברות גבוהה של קבלת החותם של פוליפפטידים דפוסים הדבקה על גבי הבדיקות להציב תאים על גבי הבדיקות, והפגינו מיקום של תאים על בדיקה ^17,18.

NRCC היא גם מפתחת שבב polyimide microfluidic תיקון, מלחציים ¹⁹ עם קיבול דומה לזה של זכוכית פיפטה. המטרה הסופית של הפרויקט היא מרובה בדיקות תיקון-מהדק שבב המאפשר ניטור סימולטני של פעילות אלקטרו של נוירונים מספר העוסקים בהתנהגות רשת ברזולוציה של תעלות יונים בודדים ^14. שיטה זו היא שיטה ברזולוציה גבוהה משלים מרובת אלקטרודה arrays 20.