Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

סיכום

אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של mycobacteria במבחנה, אשר משתמשת הכתב, גן מתויג mycobacteria במקום להרכיב המושבה יחידות (CFU). "הישרדות" של אורגניזמים כמו גם לארח בתגובה-סמנים נמדדים בעת ובעונה אחת, מתן בעלות נמוכה, מערכת תכליתי ופונקציונלי ללימודים של המארח / הפתוגן אינטראקציות בהקשר של שחפת.

תקציר

מבחני פונקציונלית שיחקו זמן רב תפקיד מרכזי מדידה של immunogenicity של החיסון נתון. זה בא לידי ביטוי קונבנציונלית כמו titers bactericidal בסרום. מחקרים titers bactericidal בסרום בתגובה חיסונים בילדות אפשרו לנו לפתח לאמת חתוכים רמות המערכת החיסונית מגן כגון לחתוך-offs נמצאים בשימוש שגרתי. מבחני אין כאלה ננקטו קדימה לתוך הערכה שגרת חיסונים לגרום בעיקר התא בתיווך חסינות בדמות מפעיל התגובות תא T, כגון שחפת חיסונים. במודל חיה, הביצועים של מועמד חיסון נתון מוערך באופן שגרתי מבחני bactericidal סטנדרטית, וכל הנוכחית TB-חיסון מועמדים הרומן היה נתון בשלב זה להערכה שלהם לפני שלב 1 בניסויים בבני אדם. הערכת immunogenicity ולכן הסבירות של יעילות ההגנה של החיסון נגד שחפת רומן רצוי לעבור הערכה דומה צעד חכם של מודלים אנושיים עכשיו, כולל מדידות מבחני bactericidal.

מבחני bactericidal בהקשר של מחקר חיסון שחפת כבר מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity. עם זאת, אין מבחני כאלה שולבו ניסויים קליניים עבור חיסון נגד שחפת הרומן עד כה.

אמנם יש עדיין אי ודאות לגבי המנגנונים המדויקים שהובילו להרג של mycobacteria בתוך מקרופאגים אדם, האינטראקציה של מקרופאגים ותאי T עם mycobacteria נדרש בבירור. Assay המתואר במאמר זה מייצג דור חדש של מבחני bactericidal המאפשר מחקרים כאלה רכיבים סלולריים מפתח עם כל הגורמים הסלולר הלחות אחרים הנמצאים בדם שלם מבלי לעשות הנחות על התרומה היחסית הפרט שלהם. Assay שתואר על ידי הקבוצה שלנו משתמשת בנפחים קטנים של דם שלם כבר המועסקים מחקרים על מבוגרים וילדים TB-אנדמיים הגדרות. הראינו immunogenicity של חיסון BCG, גדל צמיחה של mycobacteria ב חולי איידס, כמו גם את ההשפעה של טיפול אנטי retroviral וויטמין D על הישרדות mycobacterial במבחנה. כאן אנחנו מסכמים את המתודולוגיה, ולהציג נתונים reproducibility שלנו באמצעות מודל פשוט יחסית, בעלות נמוכה ושדה ידידותי.

הערה: הגדרות / קיצורים

BCG לוקס = M. בוביס BCG, זן במונטריאול, הפך עם pSMT1 מעבורת הפלסמיד נושא את הגנים luxAB מ Vibrio harveyi, תחת שליטה של GroEL mycobacterial (hsp60) מקדם.
CFU = יחידת יצירת המושבה (מדד הכדאיות mycobacterial).

פרוטוקול

1. הכנת מלאי לוקס כתב BCG mycobacteria

1. לגדול BCG לוקס (M. בוביס BCG זן מונטריאול הפך עם pSMT1 המעבורת פלסמיד) עם רעד בכל 200rpm לשלב אמצע לוגריתמי ב מידלברוק 7H9 מרק המכיל גליצרול 0.2%, 0.05% tween 80 ו - 10% העשרה ADC.
2. הכן 1ml של דילול 1:10 התרבות לוקס BCG ב PBS סטרילי בתוך שפופרת luminometer (900μl PBS + 100μl תרבות BCG לוקס) בשני עותקים.
3. טעינת שפופרת המכילה N-decyl אלדהיד (המצע האנזים בלוציפראז) על חלקו האחורי של המכשיר ולוודא את המכסה מאובטח וצינורות במקום.
4. ראש luminometer מזרק עם המצע באמצעות תוכנית הממשלה, קבע להזרים 100 UCL x 3 לתוך כל אחד 3 שפופרות ריק תחול להציב luminometer.
5. טען את 2 צינורות לתוך luminometer ולקחת קריאות באמצעות תוכנית להגדיר הזרקת 100 UCL של המצע לתוך הצינור כל ולקרוא במשך 20 שניות במרווחים של 1 שניות.
6. כאשר המניה הגיעה 1x10 ⁸ RLU / ml כדי 2x10 ⁸ RLU / מ"ל (זה לוקח בערך 3-4 ימים של צמיחה), מוסיפים נפח שווה של גליצרול 30% סטרילי לתרבות בצינור בז 50 מ"ל לערבב בעדינות.
7. Aliquot 1.5ml לתוך microtube כרכים שכותרתו בורג מכסה חנות 2ml ובבית -80 ° C.

2. קביעת RLU / CFU מניות קורלציה תוכן aliquots

1. הוסף 15 מ"ל של מדיום תרבות 7H9 מידלברוק עם תוספת ADC 10% בבקבוק 200 מ"ל Erlenmeyer עם כובע פרקו.
2. הוסף 15μl של hygromycin ו 30μl Tween של 20%.
3. הסר בקבוקון של BCG לוקס מהמקפיא להפשיר בטמפרטורת החדר (RT) בקבינט בטיחות. מוסיפים את תכולת הבקבוקון למדיום והדק את המכסה.
4. דגירה עם רעד בכל 200rpm על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים.
5. ביום אחד, להמציא סדרתי של פי 10 דילולים (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000 ו - 1:100,000) להגדרה CFU.
6. הגדרת דילולים אותו במקביל כפולות, כדי לקבוע הארה (ראה חלק 1.2-1.6).
7. להכין שתי 3-תא צלחות אגר 7H11 מידלברוק (1 l של המדיום נוזל המכיל גליצרול 0.5%, תוספת OADC 10%, 1 מ"ל של Tween 20% ו - 1 מ"ל של hygromycin).
8. צלחת החוצה 100μl של דילול על כל קטע של כל צלחת באמצעות מפיצי נפרדים, הפצת נוזלי שווה על פני החדר בודדים.
9. חותם כל צלחת עם parafilm, מקום בתוך שקית פלסטיק סטרילית, חותם עם הקלטת החיטוי, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות עם מכסים כלפי מטה.
10. בדוק בקביעות עד CFUs להופיע (2-3 שבועות).
11. כדי לספור מושבות, להסיר את הצלחות מן החממה מקום על הדלפק מושבה. חשבו את הממוצע של דילול כל מהצלחות כפולים.
12. חישוב יחס RLU / CFU באמצעות RLU המקבילה וספירת CFU עבור כל דילול. היחס צריך להיות בין 3 ל 5 RLU / CFU.

3. הכנת תרבות לוקס חיסון BCG עבור לדם שלם

1. הוסף 15 מ"ל של מדיום תרבות 7H9 מידלברוק עם תוספת ADC 10% בבקבוק 200 מ"ל Erlenmeyer עם כובע פרקו.
2. הוסף 15μl של hygromycin ו 30μl Tween של 20%.
3. הסר בקבוקון של BCG לוקס מהמקפיא להפשיר ב RT בארון בטיחות. מוסיפים את תכולת הבקבוקון למדיום והדק את המכסה.
4. דגירה עם רעד בכל 200rpm על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 4 ימים.
5. הכן 1ml של דילול 1:10 התרבות לוקס BCG ב PBS סטרילי בתוך שפופרת luminometer (900μl PBS + 100μl תרבות BCG לוקס) בשני עותקים.
6. Luminometer ראש עם המצע (כמתואר לעיל), מערבולת בעדינות את 2 צינורות לטעון לתוך luminometer ולקחת קריאות (כמתואר לעיל).
7. השתמש קריאה לדלל את התרבות PBS לתת שווה ערך של ⁶ RLU 7x10 (זה ייתן inoculum דם על 2x10 CFU / ⁵ מ"ל ו - יחס של BCG על מונוציטים כ 01:01, בהנחה של ספירת מונוציטים כ - ⁵ עד 2x10 4x10 ⁵ מונוציטים לכל מ"ל דם).

4. הכנה של דם מלא

1. קח 3 עד 5 מ"ל של דם ורידי בתוך שפופרת המכילה הפרין ללא חומר משמר.
2. מעבירים את הדם אל צינור בז 50 מ"ל ו לדלל עם נפח שווה של RPMI 1640 המכיל HEPES גלוטמין ו 25mm (לא עט / סטרפטוקוקוס).
3. Aliquot 900μl דם מדולל בשלושה עותקים תוך סטרילי צינורות תכשיט לכל נקודת זמן (6 צינורות סה"כ: 3. עבור 0hrs ו -3 עבור 96hrs הגדרת צינורות נוספים timepoints נוספות, במידת הצורך.
4. 900μl Aliquot של המדיום תרבות Middlebrooks 7H9 עם 10% + תוספת ADC 50μg/ml hygromycin (המדיום זהה בשימוש לתרבות לוקס BCG) בשני עותקים עבור פקדי צמיחה.
5. הוסף 100μl של BCG בדילול לוקס אל צינור אחד של דם, כדי לשלוט על 2 הצמיחהצינורות.
6. מערבבים היטב את המקום 3 bijous עבור 96hr זמן נקודות ו 2 שולטת צמיחה בצד שלהם בחממה נדנדה ב 37 ° C, 20 rev / min (CO ₂ לא חובה).

5. מדידת הארה (ב 0hr ו 96hrs)

1. צנטריפוגה 3 bijous ב 2000g במשך 10 דקות.
2. מוציאים בזהירות 300μl של supernatant מבלי להפריע גלולה ומניחים בורג מכסה microtubes 2ml להקפיא ב -80 ° C לניתוח ציטוקינים הבאים.
3. הוסף 300μl של PBS על כל תכשיט להחליף את נפח supernatant הוסרו.
4. לשאוב את תוכנו של כל תכשיט לתוך הצינור המקביל בז 50 מ"ל ולהוסיף מים מזוקקים 8ml על צינור אחד. בגין טיימר 10 דקות.
   הערה: זהו צעד זמן רגיש, הדגירה זה לא חייב להיות כל דקות יותר מ 10, החל כאשר התאים הראשונים לבוא במגע עם מים.
5. יש לשטוף את כל תכשיט עם 2ml מערבולת של מים מזוקקים למשך 5 שניות לפני מפנה לתוך הצינור בז המקביל.
6. בסוף הדגירה של 10 דקות, צנטריפוגה צינורות בז ב 2000g במשך 10 דקות.
7. למזוג לתוך supernatant חיטוי Surfanios.
8. הוספת חרוזי זכוכית מעטים כל גלולה ו מערבולת.
9. הוסף 1ml של PBS סטרילי כדי צינור כל מערבולת.
10. ב צינורות luminometer, לעשות דילולים 1:10 למדגם כל כפולות עם (מדגם + 900μl PBS 100μl) PBS ובבית 96hr נקודת זמן. הפוך את דילולים זהה עבור כל אחד שולט צמיחה.
11. מערבולת בעדינות את הצינורות לטעון לתוך luminometer ולקחת קריאות (כמתואר לעיל)
    הערה: הקריאות בין triplicates מדגם זהה צריך להיות בתוך 15% של אחד אחר.

6. נציג התוצאות:

חשוב להשתמש בחיידקים בשלב לוגריתמי של צמיחה עבור מבחני לוקס כולו דם, גדל כלומר מעל 48-72 שעות לפני inoculating דגימות, כמו הפעילות המטבולית הוא הכי מוצלח, אם את או ישר מהמקפיא או בשלב נייח. הגידול לפני צריכה להיות סטנדרטית עבור סדרה של ניסויים כדי או 48 או 72 שעות כדי למנוע השתנות. איור 1 מציג את עקומת הגידול של התרבות נציג BCG לוקס. זמן ההכפלה הוא כ 24 שעות עד השלב נייח הוא הגיע.

1. איור נציג צמיחה עקומה של BCG לוקס מעל 96 שעות בינוני 7H9 ואת המתאם של RLU ו CFU.

למרות הערכים RLU תמיד לתאם עם CFU, מספר RLU המתאים CFU יחיד יכול להשתנות בהתאם למלאי, ולכן הוא מומלץ להשתמש המניות קפוא אותו לאורך סדרה של ניסויים כדי להבטיח ריבוי עקביים של זיהום ( משרד הפנים).

טבלה 1 מציגה דוגמא תאריך הגלם בזמן של חיסון (ט ₀₎ ו - ב 96 שעות. יחסי הצמיחה מחושבים באמצעות הנוסחה T ₉₆ / T _0, אך מרווחי הזמן אחרים יכולים כמובן גם להימדד. היא, לעומת זאת, מומלץ לא להשתמש תרבויות מעבר 96 שעות, כמו מוות של תאים משמעותי מתרחש.

טבלה 1. דוגמא של נתונים גולמיים בזמן של חיסון (T0) ו ב 96 שעות (T96) ויחסים הצמיחה מחושב מ 3 תורמים מבוגר.

בהתאם זמין אנטיגן ספציפי לערמונית התגובות זיכרון לספור ואולי גם נויטרופילים, יחס צמיחה להשתנות בין יחידים, כפי שמוצג כאן באיור 2 בדמם של ילדים עם ובלי זיהום HIV. בממוצע, ילדים צעירים יש יחס צמיחה גבוה יותר מאשר מבוגרים, מבחן טוברקולין עור (TST) + אנשים יש להם יחסי צמיחה נמוך מ-TST יש אנשים, ו-HIV-נגועים יש יחס צמיחה גבוה בשל מחסור של האוכלוסייה תא T מסוג CD4, אחד המתווכים העיקריים של התגובה החיסונית התאית mycobacteria.

איור 2 Inter-התורם השתנות:. יחסי צמיחה של T ₀ לעומת 96 שעות עבור קבוצה של חולים, בהתאם למצב HIV הבסיסית.

שחזור של יחסי צמיחה על פני תקופה של זמן מוצג באיור 3, אשר מסכם את התוצאות של 64 תורמים זוב דם פעמיים במשך תקופה של 12 חודשים מאותו תורם דימם שוב ושוב ניסויים שליטה. סיבות אפשריות של השתנות יכול להיות שינויים רגישות השתנות mycobacterial או בתוך רמות ציטוקינים המארח, כפי שנצפה ב bioassays רבים.

איור 3. (א) תורם יחיד על 12 מקרים במשך 12 חודשים. (ב) מרובות (64) תורמים על 2 מקרים מעל 12 מ 'onths.

דיון

מבחני bactericidal בהקשר של מחקר החיסון לשחפת מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity.

הדור הראשון של מבחני bactericidal אדם עוצבו באמצעות מקרופאגים לבד, נגוע מ שחפת. CFU שימש הראשי לקריאה מתוך הישרדות mycobacterial לאחר פרק זמן מינימלי של 3 שבועות. מבחני אלה הסתמכו על הכנת, מונוצי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב	חברה	חתול לא
BCG לוקס	שונים	n / a
מידלברוק אגר 7H11	בקטון דיקינסון	283810
מידלברוק 7H9 מרק	BD Biosciences	271,310 (500 גרם)
מידלברוק העשרה ADC	BD Biosciences	212352
מידלברוק תוספת OADC	בקטון דיקינסון	212240
Tween 80	סיגמא אולדריץ	274364
גליצרול	סיגמא אולדריץ	G5150
Hygromycin B	רוש	10843555001 (20ml)
N-decyl אלדהיד	סיגמא	D7384-100 גרם
אתנול (> 99.7%)	VWR	101077
סטרילי PBS	ב בית	n / a
RPMI-1640 עם L-גלוטמין, HEPES 25mm	סיגמא	R0883
מים מזוקקים מעוקרים	ב בית	n / a
ציוד
Tube luminometer (נמל בזריקות חובה)	ברטולד AutoLumat LB953 או יחיד צינור luminometer סיריוס
Luminometer צינורות, 12 x 75mm, פיירקס נטולי מסגרת	קורנינג מ VWR	99445-12
Erlenmeyer צלוחיות עם כובעים פרקו, סטרילי פוליקרבונט 250 מ"ל	קורנינג באמצעות פישר סיינטיפיק	2150329
BD אוסף Vacutainer צינורות דם (ללא חומר משמר הפרין)	BD	367676
פלקון 50 מ"ל צינורות, חרוטי	BD	352077
7ml Sterilin הדגימה פוליפרופילן תכשיט צינורות	VWR	99445-12
Sterilin יוניברסל מכולות (30 מ"ל)	מעבדת ניתוח בע"מ	128C
חרוזי זכוכית בקוטר 2 מ"מ	SigmaAldrich	Z143928
10 מ"ל pipettes והילד פיפטה	כל
1000μl ו 200μl pipettes וטיפים מסנן	כל
כללי ציוד מעבדה:
Class II בטיחות ארון ארון
מקרר (4 ° C)
סרכזת
נדנדה שייקר פלטפורמה (180 0) לערבב צינורות
Orbital שאכר החממה נקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך גדל תרבויות חיידקי