הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מבוא של צרעות טפיליות

18.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3347

⸱

7 במאי 2012

 ,  ,  , 
1Biology Department, The City College of New York, CUNY, 2The Graduate Center, The City University of New York

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

טפיל (טפילים) צרעות מהווים שיעור גדול של אויבים טבעיים של חרקים רבים, כולל תסיסנית melanogaster. נציג את הטכניקות הללו כדי להפיץ טפילים תסיסנית Spp. ולהדגים כיצד לנתח את השפעתם על המערכת החיסונית של רקמות תסיסנית זחלים.

תקציר

רוב מיני דבורי הטפילים המוכרים תוקפים את שלבי הזחלים או הבובנאות של Drosophila. בעוד ש-Trichopria drosophilae מדביקות את שלבי הבובנאות של המארח (איור 1A-C), נקבות מסוג Leptopilina (איור 1D, 1F, 1G) ו-Ganaspis (איור 1E) תוקפות את שלבי הזחלים. אנו משתמשים בטפילים אלה כדי לחקור את הבסיס המולקולרי של מרוץ חימוש ביולוגי. לדבורי טפילים יש ערך עצום כסוכני בקרה ביולוגית. רובן נושאות גורמי virulent (ארגוניות) וגורמים אחרים המשנים את הפיזיולוגיה והחסינות של המארח. ניתוח של דבורי Drosophila מספק תובנות לגבי האופן שבו אינטראקציות ספציפיות למינים מעצבות את המבנים הגנטיים של קהילות טבעיות. מחקרים אלו משמשים גם כמודל להבנת הפיזיולוגיה החסינית של המארחים וכיצד תגובות חסיניות מתואמות מנוטרלות על ידי סוג זה של טפילים.

הקוטיקולה של הזחל/בובה משמשת כקו ההגנה הראשון. שסננת הביצים של הצלעה היא מבנה חד כסיכה המעביר ביעילות ביצים אל תוך ההמולוקואל של המארח. להטלת הביצים עוקבת תגובת ריפוי פצעים בקוטיקולה (Fig. 1C, חצי חצים). חלק מהצלעות מסוגלות להחדיר שתי ביצים או יותר לאותו מארח, אף על פי שרק התפתחות של ביצה אחת מצליחה. ביצים עודפות או זחלים מתפתחים מוסמקים בתהליך שטרם הובן. לכן, צלעות אלו מכונות פרזיטואידים בודדים.

בהתאם לזן הזבוב ולמין הצחור, ביצת הצחור פוגשת את אחד משני גורלות. היא או שהתהפוך למעטפת (encapsulated), כך שהתפתחותה תיעצר (המארח בוקע; Fig. 2 שמאל); או שביצת הצחור בוקעת, מתפתחת, משתבחת וגדלה לבוגר (הצחור בוקע; Fig. 2 ימין). L. heterotoma הוא אחד המינים הנחקרים ביותר של צחורים טפיליים של Drosophila. הוא נחשב ל"כללי" (generalist), כלומר הוא יכול להשתמש ברוב מיני ה-Drosophila כמארחים1. L. heterotoma ו-L. victoriae הם מינים אחיים והם מייצרים חלקיקים דמויי וירוס המפריעים באופן פעיל לתגובת המעטפת2. בניגוד ל-L. heterotoma, L. boulardi הוא טפיל מומחה (specialist) ומגוון מיני ה-Drosophila שבהם הוא משתמש מוגבל יחסית1. זנים של L. boulardi מייצרים גם הם חלקיקים דמויי וירוס3, אם כי הם נבדלים באופן משמעותי ביכולתם להצליח על D. melanogaster1. חלק מזני L. boulardi אלו קשים לגידול על D. melanogaster1, כיוון שהזבוב המארח מצליח לעיתים קרובות לעטוף את ביצותיהם. לפיכך, חשוב להכיר את שני השותפים בפרוטוקולים ניסיוניים ספציפיים.

בנוסף לרקמות מחסום (קוטיקולה, מעי וקנה נשימה), לזחלי Drosophila ישנן תגובות חיסוניות תאיות והומורליות סיסטמיות הנובעות מתפקודי תאי הדם וגוף השומן, בהתאמה. הטלת ביצים על ידי L. boulardi מפעילה את שני זרועות המערכת החיסון1,4. תאי דם נמצאים במחזור הדם, באוכלוסיות שאינן ניידות תחת הקוטיקולה המגמנטת, ובבלוטת הלימפה. בלוטת הלימפה היא איבר המטופויטי קטן בצד הגבי של הזחל. צברי תאים המטופויטיים, הנקראים לוביים (lobes), מסודרים בזוגות לפי פלגים לאורך כלי הדם הגבי העובר לאורך הציר הקדמי-אחורי של בעל החיים (Fig. 3A). גוף השומן הוא איבר רב-תכליתי גדול (Fig. 3B). הוא מפריש פפטידים אנטי-מיקרוביאליים בתגובה לזיהומים של מיקרואורגניזמים ובעלי חיים רב-תאיים.

זיהום על ידי צרעות מפעיל שבילי סיגנלינג חיסוניים (Fig. 4)4. ברמה התאית, הוא מעורר חלוקה ודיפרנציאציה של תאי דם. כחלק מהגנה עצמית, מצטברים אגרגטים וקפסולות בתוך ההמוסול (hemocoel) של בעלי החיים המודבקים (Fig. 5)5,6. תאי דם מופעלים נודדים לעבר ביצת הצרעה (או זחל הצרעה) ומתחילים ליצור קפסולה סביבה (Fig. 5A-F). חלק מתאי הדם מצטברים ליצירת קשריות (nodules) (Fig. 5G-H). ניתוח מדוקדק מעלה כי זיהום על ידי צרעות גורם לאונות הקדמיות ביותר של בלוטת הלימפה להתפזר בשוליהן (Fig. 6C, D).

אנו מציגים נתונים מייצגים של רכיבי מסלול העברת האות של Toll, דורסאל (Dorsal) ו-Spätzle (איורים 4,5,7), ויעד המטרה שלו Drosomycin (איור 6), כדי להמחיש כיצד ניתן לחקור שינויים ספציפיים בבלוטת הלימפה ובחלל ההמולימפה (hemocoel) לאחר זיהום בצרעה. פרוטוקולי הניתוח המתוארים כאן מאפשרים גם את הפקת ביצי הצרעה (או שלבים התפתחותיים של צרעות) מההמולימפה של המארח (איור 8).

פרוטוקול

פרוטוקול הניסוי כולו מחולק לארבעה שלבים (איור 9). (1) culturing צרעות על זחלי זבוב, (2) הגדרת זיהומים והכנת חיות לנתיחה, (3) בידוד ותיקון המארח / טפיל מבנים: (4) ניתוח רקמות חיסוניות.

1. Culturing צרעות על הזחלים תסיסנית

תחזוקה של תרבויות צרעה מחייב תכנון קפדני. לעומת זבובים גדל, זה די עבודה אינטנסיבית. אנו שומרים על מושבות צרעה שלנו במעבדה על זחלים או גלמים של זן י.ו. של תסיסנית על 24 ° C. צרעות culturing כולל שמירה על מקור מתמשך של המארחים בשלב הנכון ניקוי "נגועים" צלוחיות של זבובים העולות לפני הצרעות לעשות. צרעות בשיטה haplodiploid של קביעת הזוויג ועל כן חשוב כי הנקבות הם הזדווגו לפני שהם מדביקים את בתי המלון.

  1. ביום 1, להוסיף טיפה קטנה של טרי מראשממרח השמרים קיצצו (שנעשו על ידי ערבוב של 1 מ"ל מים בערך 1 גרם של שמרים יבשים פעילים לתוך בקבוקון זבוב מזון טרי מתכון של אוכל את הזבוב אינו קריטי,. אנו גדלים זבובים על המדיום corn-meal/sucrose/agar. 50-60 מקום צעיר (2-4 בן יומו) בוגר י.ו. (או סוג אחר זן פראי למעשה) טס להטיל ביצים במשך 48 שעות ב 24 ° C.
  2. ביום 3, להסיר את הזבובים מן צלוחיות את. מניחים תוסף באז על בקבוקון עם ירידה של דבש בצד הפנימי של הפקק באז. דבש מדולל במים מזוקקים 02:01.
  3. בעזרת CO 2, להרדים הצרעות ולמיין 6-8 נקבות ו 6-8 זכרים כי הם בערך 2-3 ימים. להוסיף אותם בקבוקון המכיל 0-48 המארחים ישנים לשעה. שים לב צרעות רגישים יותר CO 2 מאשר זבובים, וייתכן צריך לכייל את החשיפה לגז. החוקרים תסיסנית לא משתמשים תחנת תקן תסיסנית עיצוב הרדמה. נקודת התחלה טובה כדי להרדים צרעות הוא להגדיר את הלחץ CO 2כדי כמחצית ממה שנדרש לזבובים anesthetizing.
  4. להחליף את התקע באז (עם דבש) על הבקבוקון. בעדינות לשים את הבקבוקון על צידו עד הצרעות להתעורר.
  5. מניחים את צלוחיות עם זחלי זבובים וצרעות ב 24 ° C חממה.
  6. זיהומים מצליחים יעכב pupariation מעט. המארחים שסבלו התקפת הצרעה אבל מסוגלים להגן על עצמם (או אם הם לא נגועים), המשך פיתוח בעקבות לוח הזמנים הרגיל וזבובים בוגרים לצאת מן puparia אלה הרבה לפני הצרעות.
  7. בהתאם מינים צרעה וטמפרטורה, צרעות eclose ב 25-30 ימים.
  8. הסר את הזבובים הבוגרים מן צלוחיות שבו צרעות מפתחים.

2. הגדרת זיהומים והכנת חיות נגועות לנתיחה

לפני שאתם מתחילים, יש כמה זכוכית נקי או צלחות פטרי פלסטיק, צלחת פיירקס לנתח עם 9 שקעים, Kimwipes, מים מזוקקים (בבקבוק שפריץ), 70% אתנול (בבקבוק שפריץ), 1X PBS (בבקבוק שפריץ), שקופיות מיקרוסקופ, ו מרית קטנה, נקייה בהישג יד.

  1. כדי להגדיר זיהומים, בצע את השלבים 1-5 לעיל. בהתאם הניסוי, ייתכן שיהיה צורך להשתמש המארחים הנמצאים בשלב דומה של פיתוח. לשם כך, egglays של 2-6 שעות ניתן להשתמש בהם זיהום.
  2. למסוק הזחלים נגוע (עבור והניתוחים של רקמות או טפילים החיסון), להסיר את התכנים של בקבוקונים לטוס לתוך כוס פלסטיק קטנה או צלחת פטרי.
  3. שימוש סטראו ו מלקחיים עדינים (פינצטה), לבחור בקפידה 6-10 הזחלים, אחד על אחד ומניחים אותם לתוך דיכאון היטב עם 1X PBS 1, ולאחר מכן להעביר אותם למים, אתנול 70%, מים, 1X PBS, ברציפות. מטרת צעדים אלה היא לשחרר את בעלי החיים של אוכל את הזבוב ניקיון יסודי ו לעקר פני השטח שלהם. לשטוף במים מדלל אתנול והאחרון שטיפה ב PBS מסיר אתנול. עבור שלב 3 להלן, מומלץ לא להשאירבעלי חיים PBS למשך זמן ארוך יותר מ -10 דקות.

3. בידוד ותיקון המארח / טפיל מבנים

רקע

בלוטת הלימפה הזחל הוא איבר קטן 7 hematopoietic. ב 3 הזחל instar, בלוטת הלימפה מכיל זוג רב של אונות הקדמי כי האגף כלי הגבי (איור 3 א, 6 ב-C, 7 א, ד). האונות הקדמי מחולקים נוספת לתוך אזורים מיוחדים בעלי תכונות תאים מיוחדים 7. אבות של שלושה סוגי תאים, plasmatocytes, lamellocytes ותאים קריסטל מתגוררים האונות הקדמי. התאים קרום הלב להפריד בין האונות הקדמי של האונות האחוריים קטנים יותר. בלוטת הלימפה תסיסנית הוא מודל hematopoiesis חרקים יונקים 8,9.

השומן בגוף דומה תפקודית בכבד של יונקים. בתגובה הלחות מופעלת על חיידקים הבאה השומן בגוף או זיהום צרעה 1,4,10. כמומכך, שילוב ייחודי של הגנים פפטיד מיקרוביאלית מופעלים ואת פפטידים מופרשים לתוך hemolymph 1. השומן בגוף גם רקמות העיקרי לייצור גליקוגן וטריגליצרידים ואחסון 11. השומן בגוף הזחל תופס נפח משמעותי של hemocoel ו, כך שלא כמו בלוטת הלימפה, קל לאתר. אנו כעת מראים כיצד לנתח את בלוטת הלימפה בגוף שומן הזחלים instar 3.

לפני שתתחיל

צריך מלקחיים עדינים (פינצטה) ואתנול לניקוי שקופיות מיקרוסקופ.

בלוטת הלימפה הזחל לנתיחה

  1. באמצעות מלקחיים עדינים, בחר נודד 3 הזחל instar לשמור 1X PBS.
  2. מניחים את הזחל לשקופית מיקרוסקופ.
  3. באמצעות מלקחיים, למקם את חיה עם הצד הגחוני למעלה.
  4. באמצעות שני זוגות מלקחיים, להחזיק את בעלי החיים משני צדי סוף האחורי (ראשי חץ 1, איור 3 א.) ו-Gently למשוך את העור המת להציג דמעה קטנה, שטחית לציפורן.
  5. Hemolymph המכיל hemocytes, המעיים, ואת השומן בגוף יתחילו לברוח לחלל הגוף. Hemolymph ניתן לקחת את "pipetteman" 10 μl לעשות מריחות, במידת הצורך.
  6. הצבת שני מלקחיים בצד ימין של חיה מתחת ווים הפה (ראשי חץ 2, איור. 3 א), בעדינות לקרוע את העור המת.
  7. הזז את שני מלקחיים לצד השמאלי של חיה מתחת ווים הפה (ראשי חץ 2, איור. 3 א) ובזהירות לעשות עוד דמעה קטנה.
  8. בעוד מחזיק את הפה ווים של בעל החיים, משוך בעדינות את העור המת לקראת סוף האחורי של בעל החיים (כמו לקלף אותה בחזרה).
  9. כמו לציפורן משוך לאחור, על המוח, הגוף שומן, דיסקים דמותי, בלוטות הרוק, וכן proventriculus יהיה חשוף. לציפורן מנותקת כיום בקצה האחורי אבל עדיין יש את כלי הגב עם בלוטת הלימפה קשור אליו.
  10. חותכים את proventriculus והעבר אותו הרחק מאזור בלוטת הלימפה. בלוטת הלימפה יהיה מתחת למוח גם אם לא יוכלו לראות את זה.
  11. בזהירות להקניט משם את הגוף בטן שומן, בלוטות הרוק, ומבנים אחרים שעשויים יושב על בלוטת. היזהר שלא לנתק את בלוטת הלימפה מבלוטת את הטבעת כלי הגבי נמצא האחורי למוח. בלוטת הלימפה ימוקמו שטוחה על שקופיות מיקרוסקופ.
  12. מוציאים בזהירות את כל רקמות נוספות מחוץ בלוטת הלימפה עד בלוטת כולו נפרש מן האונות הקדמי לסט האחרון של תאים קרום הלב.

הערה: בלוטת הלימפה גזור כמו שצריך יהיה זוג אחד של אונות הקדמי ושני סטים של האונות האחוריים לאורך כלי הגבי (איור 6 ב). האונות עלולים להיפגע בקלות או יכול לרדת מן הספינה הגב. הדגימות ולכן יש לטפל בזהירות רבה. בלוטת גם Hכמו נטייה להתכווץ או חוזה. ברכות יישר את האיבר בסוף האחורי שלה מאפשר לכל חלקי ותאי שיוצגו היטב. זה נחוץ במיוחד הפרוטוקולים immunostaining.

פיי לנתיחה הגוף

  1. על הבמה לנתח של מיקרוסקופ צייס 1000 לנתח (כל סטריאו לנתח מיקרוסקופ ניתן להשתמש), במקום בתיבת האור המאפשר לאור התקרית להיות מועבר באמצעות מדגם. הצב זחל 3 instar משלב 2 בשקופית מיקרוסקופ ב μl 200 של 1X PBS. הטה את מקור האור מן המדגם, כך האורגניזם מופיע שקוף ולכן קל לדמיין את האיברים הפנימיים שלה.
  2. באמצעות מלקחיים, מקם את חיה כך את סוף הקדמי הוא ממך.
  3. באמצעות מלקחיים, החזק לציפורן של הזחל בצד שמאל של ווים פיו (ראש חץ 1, איור. 3 ב). באמצעות מלקחיים אחרות, בעדינות לקרוע את העור המת כל הדרך עד הסוף האחורי (ע"רrowhead 2, איור 3 ב). לא לקרוע את העור המת מהגוף בסוף האחורי.
  4. בעדינות רבה להתחיל להסיר את הבטן לצד אחד.
  5. הוצא בעדינות את המוח, דיסקים דמותי, ואת בלוטת טבעת עם בלוטת הלימפה זורם כלי הגבי.
  6. אין להסיר את בלוטות הרוק מאז יש השומן בגוף דבקות אלה בלוטות.
  7. בעדינות להסיר את העור המת ולהשאיר את השומן בגוף בשקופית ב 1X PBS.

הערה 1: השומן בגוף יש רק שכבה אחת של תאים ולכן חשוב לקבל את כל התאים שטוח באותו המטוס בשקופית זכוכית. תאים הם endopolyploid וקל לדמיין. מדגם היטב גזור שומן הגוף צריך לשמור על קשרים סלולריים רגילים, ואת צריכה להיות כדוריות שומן מינימלית ברחבי מדגם גזור (איור 6I, י).

הערה 2: אם הביצים צרעה והאשראי הגלובליים המערכת החיסונית המארח, הם initiatדואר הפיתוח באופן כמעט מיידי. שלבי ההתפתחות הראשונים של הטפיל (מ הזחל המארח) נגישים בקלות hemocoel גזור (איור 8). ביצי הטפיל או זחלים או לדבוק בגוף שומן או איברים אחרים, או פשוט להחליק על גבי שקופיות הזכוכית במהלך לנתיחה.

4. ניתוח רקמות החיסון

  1. אוויר יבש בלוטות הלימפה למשך 5-10 דקות ולהסיר 1X PBS משקופית השומן בגוף לפני תיקון למשך 5-10 דקות עם paraformaldehyde 4% ערוכים PBS. כל שקופית יכולה לקבל מספר בלוטות הלימפה גזור עבור מכתים. להעביר שקופיות עם דגימות קבועות אל חדר humidified תוצרת בית על הצעדים הבאים. תא זה הוכן על ידי הצבת שתי פיסות נייר, מגבות מקופלות לחים בחלק התחתון של קופסת פלסטיק ריקה micropipette עצה. אחד או יותר שקופיות עם דגימות ניתן למקם על גבי מחיצה המשמש מחזיק את הטיפים.
  2. לפיכך, ניתוח של רקמות חיסוניות נעשה בעקבות שיטות סטנדרטיות, כילשלב תיוג תא vivo ו 4 אימונוהיסטוכימיה עקיפה.

5. נציג תוצאות

  1. זיהום צרעה מפעיל הביטוי של עיתונאי שיחת מסלול Drosomycin-GFP (איור 6G, י). בניסוי זה, את השפעת התפשטות-הצרעה על ביטוי גנים הוא דמיינו in vivo באמצעות ה-GFP, כתב קשור האמרגן בני הזוג 12. אצל בעלי חיים נגוע שליטה, ביטוי של GFP הוא לא זוהה. אות ה-GFP הוא זוהה בבירור הציטופלסמה לבין הגרעין של התאים של הגוף את השומן, גזור מבעלי חיים נגועים ל victoriae. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, היחס בין צרעות: בתי הארחה צריכה להיות 01:10. זיהום צריך להימשך לפחות 2 שעות. התפשטות פוסט, את בני הזוג-GFP מעצים אות והרבה תאים השומן בגוף הם GFP חיובי אפילו עד 72 שעות 1,4.
  2. זיהום צרעה גורם הבידול של lamellocytes ב lבלוטת ymph (איור בקר 6d). Lamellocytes להקיף ולחסום פיתוח צרעה (איור 6 שעות). בלוטות הלימפה הן גזור לדמיין את השינויים הסלולר המושרה באונות הקדמי לאחר ל victoriae זיהום. החדש הבדיל lamellocytes נמצאים בפריפריה של האונות גזור; lamellocytes מסומנים transgene GFP, כי הוא מונע על ידי משפר מעוות (MSNF9-GFP). כל התאים הם דמיינו עם אקטין פילמנטיות באמצעות rhodamine שכותרתו phalloidin. שימו לב כי שלמות של האונות הקדמי מופרת אלה בלוטות כמו קרום במרתף, כי בדרך כלל סביב האונה ברציפות (איור 6C), הוא כעת רציפה (איור בקר 6d). מ והניתוחים אותם, lamellocytes ב hemolymph יכול להיות גם דמיינו מריחות (איור 6G); שחלקם קשורים למבנה הקפסולה נוצר כדי לחסום טפיל פיתוח (איור 6 שעות).
  3. Sחלבון pätzle באה לידי ביטוי ברוב התאים של בלוטת הלימפה הזחל (איור 7C, ד). כדי לזהות Spz בבלוטות הלימפה גזור, הלכנו בעקבות פרוטוקול סטנדרטי מכתים התאים של בלוטת לימפה עם אנטי Spz נוגדנים polyclonal 4. בחי Spz רמות גידול תאים בלוטת הלימפה לאחר ההדבקה צרעה (השוו לוחות איור. 7C, E עם 7G, I ו-7D לוחות, F עם 7H, י).
  4. בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התפתחות הצרעה של זחלים וגלמים המארח (איור 8). כדי לבחון את שלבי ההתפתחות של צרעות, זחלים הנגועים גזור בנקודות זמן שונות לאחר ההטלה. כאן אנו מצביעים על דגימה של שלבים אלה מ Leptopilina spp. מסוג פראי נגוע ד melanogaster מארח.

איור 1
באיור 1. מינים שונים צרעה ההטלה של הביצה צרעה. כל התמונות התקבלו באמצעות סטראו לייקה. צרעה drosophilae Trichopria נקבה oviposits ביצה לתוך ד ' melanogaster גולם. הגדלה ב 'של ההטלה של Trichopria drosophilae לתוך המארח גולם. נקודות ג Melanized מצביעים על ריפוי הפצע באתר ההטלה. D ל boulardi זכר. E G. xanthopoda הנשי. F ל נשים victoriae. G ל heterotoma זכר (שמאל) ונקבה.

איור 2
איור 2. מחזורי החיים מראה את המירוץ זבוב / צרעה נשק. תוצאות ההטלה של אחת משתי תוצאות. בין אם מארחים תגובות חיסוניות מצליחים לחסום את הפיתוח של צרעה (משמאל), או צרעה מסכלת respo החיסונית של המארחnses ומצליח (מימין). שונה מ מלק וגובינד, 1999 18.

איור 3
איור 3. השלישי הזחלים instar מראה את האיברים של עניין לפני לנתיחה. כל התמונות התקבלו באמצעות סטראו לייקה.> Hml הזחל GFP עם GFP (ירוק) פלואורסצנטי (חץ) בתאים בודדים של בלוטת הלימפה מציין את המיקום הכללי של בלוטת הלימפה ב בעלי חיים ללא פגע. הזחל היה צילמו עם אופטיקה שדה הקרינה ובהיר. ראשי חץ להצביע על מקומות חשובים עבור פרוטוקול בלוטת הלימפה לנתיחה המתוארת בטקסט. ב Cg> זחל GFP עם ביטוי של GFP שומן בגוף כדי לציין את המיקום של איבר בבעלי שלםאל. ראשי חץ להצביע על מקומות חשובים עבור פרוטוקול לנתיחה שומן הגוף המתואר בטקסט.

איור 4
באיור 4. חיסוני גנטית מעגל התגובה החיסונית נגד המארחת מרכיבי הליבה טפיל ההתקפה. של נתיב אגרה מוצגים. Spätzle (Spz) מופעל על ידי אנזים פרוטאז עיבוד Spätzle, SPE. פעיל Spz משמש ליגנד עבור האגרה. איתות תאיים מוביל ההפעלה של NF-κB גורמי תעתוק, הגב ו DIF. קקטוס משמש מעכב IκB של מסלול. הפעלת Drosomycin, מחיר הקנונית מסלול הגן היעד, ניתן לנטר באמצעות זני זבובים מהונדס עם כתב ה-GFP (ראה איור. 6I, י).

איור 5
איור 5. Encapsulation בתגובה ל victoriae התפשטות ב> GFP-dl נחש מארחים תסיסנית. משפר בגן הנחש בא לידי ביטוי בתאי הדם 13. כאשר משפר זה שמניע את הביטוי של חלבון ה-GFP-הגבי היתוך transgene, הגבי מזוהה באמצעות פלואורסצנטי ירוק של ה-GFP בכמה plasmatocytes ו lamellocytes שמרכיבים את הכמוסות אגרגטים. כל התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ LSM Zeiss confocal. ביצת ל בהגדלה victoriae. Lamellocytes BD (חיצים לבנים) בקצה האחורי של ה-GFP-Express ביצה הגבי. תקליטורים גבוהות יותר של המדגם בלוח ב 'EH דוגמאות counterstained עם rhodamine שכותרתו phalloidin לדמיין אקטין פילמנטיות (F-אקטין, אדום) ועם Hoechst 33258 לדמיין (כחול) ה-DNA. E Encapsulated ביצת ל victoriae. F הקפסולה Melanized של ל victoriae. GH ל victoriae infection גורם תא דם (plasmatocyte ו lamellocyte) צבירה.

איור 6
איור 6. התגובה החיסונית נגד זיהום צרעה. תמונות של לוחות A ו-B התקבלו באמצעות היקף Axio Zeiss. תמונות לוחות CJ התקבלו באמצעות מיקרוסקופ LSM Zeiss confocal. הזחל מארח מראה צרעה melanized ביצה כמוס (ראש חץ) באמצעות לציפורן שקוף. B נציג בלוטת 3 instar הזחל הלימפה מוכתם Hoechst 33258 מגלה התאים של כל האונות והתאים קרום הלב וביניהם. סרגל קנה מידה מייצג μ 100. CJ כל הדגימות היו counterstained עם Hoechst 33,258 (כדי גרעינים התווית) ו rhodamine phalloidin (לתייג F-אקטין). תקליטור בלוטת הלימפה הקדמי אונות מהשלט (C) ול ' victoriae נגועים (ד ') MSNF9-GFP חיים. אצל בעלי חיים נגועים, ביטוי MSNF משפר, ספציפית להmellocytes 14, מזוהה עם כתבת ה-GFP גרעינית. Plasmatocytes ה מבודדים מבעלי חיים נגוע לא להביע את ה-GFP. בעלי חיים אלה יש מעט מאוד אם בכלל. Lamellocytes פריץ Plasmatocytes (GFP שלילי, חץ קצר) ו החדש הבדיל, lamellocytes גדולים יותר (חיצים ארוכים) עם ביטוי חלש GFP גרעינית ל victoriae-נגוע MSNF9-GFP הזחל. ז plasmatocytes חינם מצטבר ו lamellocytes מ hemocoel של ל ' victoriae-נגוע בני הזוג-GFP הזחל. הביטוי של העיתונאי בני הזוג-GFP מופעלת בכמה plasmatocytes (חץ קצר), אך לא lamellocytes (חיצים ארוכים) לאחר זיהום. H הגלום ו זחל הצרעה melanized מ ל boulardi נגועים MSNF9-GFP הזחל המארח. רבים MSNF9-GFP חיובי lamelloctyes מקיפים את זחל הצרעה (מבנה חשוך, חץ עבה) ולהציג GFP חזקה ביטוי גרעינית (חיצים ארוכים). זה פאןאל שפורסם בעבר ב PLoS ONE 15. ij בתאי השומן בגוף גזור מן נגוע (אני) ול ' victoriae-נגוע (י) בני הזוג-GFP הזחל. ה-GFP הוא גרעינית cytoplasmic בתאי השומן בגוף של בעלי חיים נגועים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 7
איור 7. הביטוי Spätzle לאחר ההדבקה הצרעה טפיל. דוגמאות AJ היו counterstained עם Hoechst 33258 לדמיין DNA. כל התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ LSM Zeiss confocal. אונות מיקוד אוטומטי הקדמי גזור מן הזחלים י.ו. נגוע. דוגמאות עובדו על immunostaining עקיפה ללא נוגדן ראשוני (A ו-B) או עם נוגדנים נגד Spz (אדום, C, D, E, F) counterstained עם Alexa קמח phalloidin לתווית ה-F-אקטין בתאים (ירוק;. B, D, F) GJ אונות הקדמי גזור מן הזחלים י.ו. צבעונית נגוע עם נוגדנים נגד Spz (אדום, G, H, I, J) ו-Alexa פלואוריד phalloidin (ירוק. לוחות H, J) מסחר ותיקון כלי בהגדלה גבוהה של דגימות C ו-D בהתאמה. בהגדלה ij גבוהות יותר של דגימות ב G ו-H, בהתאמה. ברים בקנה מידה לספירה לוחות, G, H מייצגים 50 מיקרומטר.

איור 8
איור 8. שלבי הזחל ו גלמי של ל heterotoma ול ' boulardi. בשלבים אישיות בודדו משריצה המארחים הזחל או גלמי זבוב הודעה, כפי שצוין. כל התמונות התקבלו באמצעות היקף Axio Zeiss. למעלה בשורה AF ל בשלבים heterotoma, 1-6 ימים לאחר ההדבקה. שורה תחתונה AF Postembryonic ל boulardi שלבים, 4 עד 12 ימים לאחר ההדבקה.

figure-protocol-9 איור 9. תרשים זרימה של פרוטוקול הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עניין צרעות טפיליות של תסיסנית גועשת כמו שיטות מולקולריות כדי לפענח גנומים שלמים להיות יעיל וחסכוני. עם זאת, ביחס במיוחד שלהם היטב למד המארחים, היבטים מרתקים רבים של הביולוגיה צרעה להישאר אלמוני. אלה כוללים נושאים הקשורים לארח מגוון, דיכוי המערכת החיסונית, superparasitism, והתנהגות. המיקוד של מצגת זו היה כדי להדגים את השפעת הזיהום על הרקמות החיסוניות של זבובים. טכניקות את הנתיחה הפגינו כאן ניתן להשתמש לצורך ניתוח של ביטוי גנים ברמת RNA (ב ההכלאה באתרם), ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תודות

אנו מודים לפרופ 'טוד Schlenke עבור Trichopria drosophilae, פרופ' טוני Ip עבור זני זבובים מהונדס, ופרופ 'קרל השימוטו עבור אנטי Spätzle נוגדנים. אנו מודים לחברי ההווה ושל העבר הקרוב של המעבדה על תרומתם במצגת זו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הבאים: מ-NIH (S06 GM08168, עלייתו 41399-009, G12 ו-RR03060), משרד החקלאות האמריקאי (NRI / משרד החקלאות CSREES 2006-03817 ו 2009-35302-05277) ו PSC-CUNY.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

Genesee מדעי
רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרים סוג חברה מספר קטלוגי
חומרי תחזוקה התרבות חרקים
שמרים פעיל יבש פישר סיינטיפיק S802453
טוס מזון קמח תירס, סוכר מתכון רגיל
דבש תלתן ההולנדי זהב
בקבוקונים פוליפרופילן פגז בקבוקונים (צר) פישר סיינטיפיק AS514
הבקבוקון סגרים קוטון תקע פישר סיינטיפיק AS212
הבקבוקון סגרים באז התוספת AS273
בקירור החממה דיוק 815 Thermo Scientific 3721
חומרים עבור הכנת המדגם
CO 2 מיכל כיתה יבש העצם ט"ו סמית UN1013
מרית מרית מיקרו (14 ס"מ) פישר סיינטיפיק 21-401-15
הבדיקה פיירקס ספוט צלחות 9-85 גם לנתח את הצלחת מ"מ X 100 מ"מ תומאס מדעי 7812G17
פסטר טפטפות סודה לימון J & H Berge 71-5200-05
מצבטים סגנון # 5 סיגמא T-4662
אתנול 190 הוכחה USP פישר סיינטיפיק 04-355-221
פורמלדהיד 37% w / w פישר סיינטיפיק F79-1
משני הנוגדנים Cy3 AffiniPure חמור נגד ארנב IgG (H + L) 1:50 עירור 546 ננומטר, 565 ננומטר פליטה ג'קסון חיסונית מעבדות מחקר, Inc 711-165-152
Antifade (N-גאלאט) 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​גליצרול 50% 1X PBS מגה פיקסל Biomedicals 10274790
גליצרול פישר סיינטיפיק G33-1
Hoechst 33258 0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​עירור 352 ננומטר, 461 ננומטר פליטה בדיקות מולקולריות H-1398
Rhodamine phalloidin 200 יחידות / מ"ל ​​(6.6מיקרומטר) עירור 540 ננומטר, 565 ננומטר פליטה בדיקות מולקולריות R415
Alexa פלואוריד 488 phalloidin 300 יחידות / מ"ל ​​עירור 495 ננומטר, 518 ננומטר פליטה בדיקות מולקולריות A12379
Disposables
לשטוף את הבקבוק Fisherbrand פישר סיינטיפיק 03-409-22A
Kimwipes קימברלי קלארק פישר סיינטיפיק 06-666A
נייר מגבת 1 רובדי C פי נוצה 901-7CFTB2400
מיקרוסקופיה  
לייקה סטראו MZFLIII האימפריה Imaging Systems, Inc 10446208
Zeiss סטראו STEMI 1000 או 2000-C Carl Zeiss 000000-1006-126
מקור אור - LED שולחן מתכווננת הפנס פישר סיינטיפיק 12563501
שלב תיבת אור מסור עם צלחת Carl Zeiss 455137000
Zeiss סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal LSM 510 Carl Zeiss
Zeiss תרכובת מיקרוסקופ Axioplan 2 זקוף Carl Zeiss
צרעה זנים טוס מסנניםשל
Leptopilina victoriae 16 י.ו.
Leptopilina boulardi 17 1 כטב"מ-GFP-הגבי 17
Leptopilina heterotoma 2 SerpentHemoGal4 13
Leptopilina heterotoma 14 1 MSNF9-moCherry 14
Trichopria drosophilae MSNF-GFP 15
Ganaspis xanthopoda 18 י.ו. הנחש-Gal4 כטב"מ GFP-Dorsal/Basc 4
י.ו.; Drosomycin-GFP/CyO Y + 12

מקורות

  1. Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
  2. Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
  3. Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
  4. Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234(2010).
  5. Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
  6. Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
  7. Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
  8. Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
  9. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
  10. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
  11. Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199(2007).
  12. Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
  13. Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
  14. Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
  15. Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429(2009).
  16. Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
  17. Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
  18. Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מארחי דרוזופילהדיסקציה של בלוטת הלימפהבידוד גוף שומניתחזוקת תרביות צרעותניתוח רקמות חיסוניותמיצוי המולימפהטכניקת קילוף קוטיקולהמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתניתוח ביטוי גנים
מבוא של צרעות טפיליות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.