הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

סיכום

אנו מתארים שיבוט מולקולרי של הנגיף maedi-visna המבטא GFP ו מדבק לחלוטין. שכפול של וירוס זה ניתן לגילוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.

תקציר

Maedi-visna וירוס (MVV) הוא lentivirus כבשים, גורם לדלקת ריאות ביניים מתקדמת לאט דלקת קרום המוח ^1. התאים היעד העיקרי של MVV in vivo נחשבים של ² את השושלת מונוציטים. זנים מסוימים של MVV יכול לשכפל סוגי תאים אחרים, לעומת זאת ^3,4. חלבון פלואורסצנטי ירוק הוא סמן הנפוץ לחקר lentiviruses בתאים חיים. אנחנו צריכים להכניס את הגן egfp לתוך הגן עבור dUTPase של MVV. הגן dUTPase נשמרת היטב זנים lentivirus ביותר צאן ו הוכח להיות חשוב שכפול של CAEV ^5. עם זאת, dUTPase הוכח להיות מיותר עבור שכפול של שיבוט מולקולרי של MVV השתמשו במחקר זה הן במבחנה in vivo ^6. שכפול MVV מוגבל אך ורק תאים של כבש או עז מוצא. אנו משתמשים בקו התא הראשוני של מקלעת דמית העין של כבשים (תאים SCP) עבור transfection ואת התפשטות של הנגיף ^7. MVV פלורסנט מדבק מלא הבעה EGFP יציב על לפחות 6 קטעים ^8. קיימת קורלציה טובה בין מדידות של TCID ₅₀ ו EGFP. וירוס זה ולכן צריך להיות שימושי עבור זיהוי מהיר של תאים נגועים במחקרים של כמיהות התא pathogenicity במבחנה in vivo ^8.

פרוטוקול

1. Transfection

שיבוט מולקולרי נכלל בשני פלסמידים, p8XSp5-egfp ו p67r, של 12 קילו ו 4.5 kb בהתאמה. ^9,10

1. גזור כמויות equimolar של שני פלסמידים, כלומר 4.4 מיקרוגרם של p8XSp5-egfp ו -1.6 מיקרוגרם של p67r עם XbaI ו ולקשור לפני transfection.
2. עבור קשירת, השתמש וייס 1 יחידה של האנזים בתגובה 50 דגירה μl ובו 16 ° C במשך הלילה.
3. כאשר קשירת הושלמה, דגירה תמהיל קשירת על 65 מ....

דיון

GFP להביע שיבוט מולקולרי של MVV המוצגים כאן צריך להיות שימושי לניתוח מארח תאים אינטראקציות pathogenicity של MVV הן במבחנה in vivo. הווירוס מתקבל לאחר 7-14 ימים של שכפול רכשה ללא ספק כמה מוטציות עקב אי דיוק של reverse transcriptase. עם זאת, ישנן מגבלות על השימוש שיבוט זה כמו וקטור מחזור אחד. האחת היא השימוש המשובט מוגבל תאים של כבשים ממוצא עז. יעילות transfection של תאים אלה באמצעות לבנות שלנו הוא רק 5-15%, ושימוש וקטור pEGFP-N3 את היעילות transfection הוא 15-20% לעומת 90% מעל 293 .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
DMEM	Gibco	10938025
Opti-ממ	Gibco	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019