חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores

סיכום

השיטה של ​​שימוש מצב מוצק nanopores לפקח על הלא ספציפית ספיחה של חלבונים על פני השטח אורגניים מתואר. השיטה משתמשת בעיקרון דופק-התנגדות, ומאפשר ספיחה להיות נחקר בזמן אמת והן ברמת מולקולה בודדת. בגלל תהליך ספיחה של חלבון יחיד רחוק שיווי משקל, אנו מציעים את העסקתם של מערכים מקבילים של nanopores סינתטי, מה שמאפשר לקביעת כמותית של קצב מסדר ראשון נראית לעין תגובה קבועה של חלבון ספיחה, כמו גם את לאנגמיור ספיחה מתמדת.

תקציר

מצב מוצק nanopores שימשו כדי לבצע מדידות ברמת יחיד המולקולה לבחון את מבנה הגמישות המקומית של חומצות גרעין ^1-6, את התגלגלות של חלבונים ^7, זיקה מחייבת של ligands שונים ^8. על ידי צימוד אלה nanopores לטכניקה הדופק התנגדות, ^12/09, מדידות כאלה ניתן לעשות זאת תחת מגוון רחב של מצבים רחב ללא צורך תיוג ^3. בטכניקה התנגדות, דופק, פתרון מלח יוניים הוא הציג על שני הצדדים של nanopore. לכן, יונים מונעים מצד אחד של החדר לצד השני על ידי פוטנציאל הטרנסממברני מיושם, וכתוצאה מכך זרם יציב. חלוקת אנליטי לתוך nanopore גורמת סטיה מוגדרת היטב בזרם זה, אשר ניתן לנתח כדי לחלץ מידע יחיד מולקולה. באמצעות טכניקה זו, ספיחה של חלבונים יחיד על הקירות nanopore יכול להיות פיקוח תחת מגוון רחב שלהתנאים ^13. חלבון ספיחה גוברת בחשיבותו, כי כמו מכשירים microfluidic לכווץ בגודל, את האינטראקציה של מערכות אלה עם חלבונים יחיד הופך לדאגה. פרוטוקול זה מתאר assay מהיר של חלבון מחייב סרטים ניטריד, אשר יכול בקלות להיות מורחבת סרטים דקים אחרים מקובל קידוח nanopore, או משטחים ניטריד פונקציונליות. מגוון של חלבונים עלול להיחקר תחת מגוון רחב של פתרונות ותנאי denaturing. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור יותר בעיות בסיסיות באמצעות ספקטרוסקופיית nanopore.

פרוטוקול

1. תוצר של מצב מוצק nanopores ממברנות סיליקון ניטריד

1. תביא / פיי Tecnai S F20 TEM למתח האצה של kV 200. אם אתה משתמש שונה S / TEM, מתח ההאצה צריך להיות גדול או שווה ל 200 kV ⁹
2. טען 20 ננומטר חלון עבה SPI סיליקון ניטריד רשת לתוך מחזיק מדגם TEM ונקי עם פלזמה חמצן למשך 30 שניות כדי להסיר מזהמים מבעל.
3. טען המדגם אל S / TEM ולאפשר ואקום כדי לשאוב למטה. לאחר S / TEM יש נשאבים אל הריק, למצוא את חלון ניטריד במצב בהיר שדה TEM ידי מחפש ריבוע בהיר על Ronchigram. ודא TEM מיושר כמו שצריך, אז ליישר ולמקד את המדגם.
4. כבה את S / TEM למצב גזע. השתמש גלאי (או שווה ערך) HAADF לתמונה מדגם וודא שהוא מיושר כראוי.
5. הגדר את monochromator לערך נמוך. ערך נמוך של monochromator מאפשר curren גבוה יותרt של אלקטרונים עבור קידוח. אם S / TEM אין monochromator, התעלם משלב זה.
6. בחר גודל נקודה מתאימה לקידוח nanopore. זה מתאים בקוטר של החללית אלקטרונים. בדיקה 3 ננומטר עובד היטב עבור קידוח בקוטר 5 הנקבוביות ננומטר. בדיקה גדול (5 ננומטר) יהיה לקדוח מהר יותר וליצור נקבוביות גדולות יותר. בדיקה קטן (1 ננומטר) ייקח זמן רב יותר כדי לתחקר וליצור נקבוביות קטנות יותר.
7. התאם את יישור גזע, במידת הצורך.
8. פוקוס הממברנה ניטריד ולהביא אותו בהגדלה של x1.3M. התמקדות פיין צריך להיעשות על ידי ניטור Ronchigram.
9. אם יש תנועה של המדגם, ואז לחכות למדגם לייצב. זה יכול להימשך עד שעה. בלנק אלומת אלקטרונים בזמן ההמתנה, כדי לא לגרום נזק ניטריד.
10. מניחים את החללית אלקטרונים על המדגם ולהתחיל לקדוח.
11. מפעם לפעם לבדוק את המדגם על ידי סריקה עם הגלאי HAADF, הן כדי לוודא nanopore היא להיות DRIlled (זה ייראה כמו כתם כהה) ולבדוק כי אין תנועה של המדגם. אם המדגם נסחפת קצת, להתאים את המיקום של החללית האלקטרון להיות מעל nanopore.
12. צפה Ronchigram לזהות כאשר הנקבובית יצרה. כאשר במוקד, הסרט ניטריד יש מראה מנצנץ. זה יעלם כאשר צורות nanopore. לשים את Ronchigram קצת מחוץ לפוקוס מאפשר לראות שוליים פרנל הקשורים nanopore.
13. קח תמונה של nanopore עם HAADF.
14. האם פרופיל העוצמה של התמונה nanopore. בקוטר של nanopore ניתן לחשב לפי אזור האפלים ביותר של הפרופיל.
15. ההרחבה של nanopore עשוי להתבצע על ידי העברת אלקטרון בדיקה בשולי הנקבובית.
16. לאחר nanopore הוא בקוטר הרצוי, את S / TEM למצב TEM.
17. תביאו את monochromator להגדרה הסטנדרטי שלה והתמונה nanopore באמצעות בהיר שדה TEM לאשר את גודל

2. הרטבת nanopore של מצב מוצק

1. De-de-גז מיונן מים המכילים 1 M KCl, 10 mM אשלגן זרחתי, pH 7.4. ניתן לעשות זאת על ידי הצבת הפתרונות תחת ואקום הכנסתם sonicator אמבטיה במשך 20 דקות.
2. מניחים את ניטריד nanopore המכיל שבב סיליקון לתוך כוס פיירקס 10 מ"ל. היזהר שלא לשבור את החלון ניטריד כפי שהוא עדין מאוד. הנח את הכוס על פלטה חמה במנדף קטר ולהגדיר עד 100 ° C.
3. נקו את שבב nanopore עם פתרון פיראניה שימוש בזהירות רבה. ראשית להוסיף 3 מ"ל חומצה גופרתית למיכל באמצעות פיפטה מזכוכית. לאחר מכן, בזהירות להוסיף 1 מ"ל מי חמצן לחומצה גופרתית כדי להפוך פתרון פיראניה ^14. בבקשה לנקוט בכל אמצעי הזהירות.
4. אפשר שבב nanopore לטבול בתמיסה פיראניה במשך 10 דקות.
5. הסר את הפתרון פיראניה מן הקנקן באמצעות פיפטה מזכוכית. המקום אותו לתוך כלי קיבול האחסון הנכון.
6. Fiכוס עם מים בגז דה דה מיונן, בעזרת פיפטה זכוכית נקי יהיה. כוס ריקה של מים חוזרים לפחות 5 פעמים.
7. הסר את שבב nanopore עם פינצטה נקי ויבש זה על ידי יניקה אור
8. מיד, חותם את השבב nanopore לתוך תא (איור 2a, 2b). השבב עשוי להיות מאובטח בתא על ידי O-טבעות או סיליקון איטום.
9. ממלאים את החדר עם פתרון KCl
10. חבר את Ag / AgCl אלקטרודות לתאי (איור 2b). אלקטרודות עשוי להתבצע על ידי השריית חוט כסף להלבין בן לילה.
11. החלת פוטנציאל הטרנסממברני פני האלקטרודות ולנטר את התגובה הנוכחית באמצעות 200B אקסון תיקון-clamp מגבר במצב מתח מהדק.
12. לבנות עקומת I / V (מתח הנוכחי) מן המדידות. עקומת I / V צריך להיות ליניארי מאוד בעת שימוש KCl 1 M (איור 3). המוליכות של nanopore צריך להתאים לקוטר שלו. אם nanopore לא להציגליניארי אני / V עקומה, מוליכות נמוכה מדי, או הנוכחי הפתוח של nanopore אינו יציב (איור 4 א), פירוש הדבר כי nanopore לא הרטובות כראוי כביסה פיראניה יש לחזור.

3. חלבון ניטור ספיחה

1. חשוב ביותר לבצע ניסויים מלאה עם קרום חד nanopore או מערך מקביל של nanopores (ראה להלן) כדי לנטר את זרם עם התנאים חיץ חסר המדגם חלבון. אנו ממליצים על שני השלבים הבאים: (i) השימוש חיץ טוהר ברמה גבוהה (טוהר> 99.9%; כרומטוגרפיה כיתה ברמה), (ii) את השימוש חיץ אשר האינטראקציה עם מצב מוצק nanopore לא לייצר יחידה ערוץ אירועים. בנוסף, אנו ממליצים על קבלת מדגם הטוהר גבוהה חלבון באמצעות תקן כימיה נהלים חלבון. טוהר המדגם חלבון צריך להיבדק על ידי ניתוח dodecyl נתרן סולפט-polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE) ברזולוציה גבוהה מאss ספקטרומטריית ^15.
2. הוסף מדגם מטוהרים של החלבון כדי להיחקר לאמבטיה מקורקע של החדר. לאפשר זמן המדגם כדי לפזר ברחבי באמבטיה. ריכוזים אופייניים של חלבון זה ניתנת למדידה הן של עשרות nM למגוון מיקרומטר ^7,15-21.
3. החלת מתח פוטנציאל הטרנסממברני הטיה עם קוטביות הפוכה לזו של תשלום הכולל של החלבון הנחקר. לדוגמה, ארגון ה-BSA יש מטען שלילי נטו יעיל ב-pH 7.4, ולכן הטיה מתח חיובי צריך להיות מיושם. המתח להחיל יוצרת שיפוע הפוטנציאל בתוך הפנים וחלבונים nanopore של חיובים מול יהיה מונע על ידי כוחות מנוגדים. רק הקטבים מתח המניעים את החלבונים לתוך nanopore תיצור אותות מדידים.
4. הפוטנציאל היישומי של גודל של mV 200 צריך להיות גדול מספיק כדי להתבונן analytes חלבון ביותר. אירועים יופיעו deflections הנוכחית חולף מנקודת ההתחלה (איור 4 ב).אם אין אות הוא ציין, להגדיל את הריכוז של חלבון בתא. מתח גבוה לשפר את יחס אות לרעש. Nanopores Nitride יכול לעמוד כמה וולט.
5. Adsorptions חלבון יופיעו חיים ארוכים שינויים הבסיס הנוכחי של nanopore (איור 4c).

4. אפשרויות functionalization של nanopores

קיימות מספר שיטות ליישום קבוצות פונקציונליות על סיליקון ניטריד ^22,23. סרטים ניטריד רוב שכבת תחמוצת דקה בחוץ וחשיפה האוזון יכול ליצור שכבת תחמוצת נוסף, במידת הצורך. Organosilanes שונים ניתן להשתמש עצמית המורכב על גבי שכבות כאלה. מעניינת במיוחד היא aminosilane, אשר עצמית מרכיב והוא יכול להיות שונה יותר (חומצה כלומר, carboxylic ו אלדהידים), המאפשר בדיקה של מגוון רחב של משטחים אורגני. לאחר nanopore נחפף עם דגי פיראנה טורפים ומאובטחת ב chamber, אמין ניתן להוסיף ישירות באמבטיה קאמרית עם אלקטרוליט תומכת של 0.5 M TBACl (tetrabutylammonium) ו anhydrous MeOH (מתנול) המשמש כממיס. היווצרות monolayer יכול להיות פיקוח על ידי יישום של הטיה mV 400 מתח המדידה של ירידה הנוכחי ^23.

5. קביעת לכאורה מסדר ראשון שיעור התגובה מתמיד לאנגמיור ספיחה קבוע באמצעות מערכים מקבילים nanopore

5.1 לכאורה מסדר ראשון שיעור התגובה קבועים עבור קליטה desorption

אנו מדגישים כי הפן החיובי של מתודולוגיה זו היא היכולת שלה להתבונן adsorptions הפרט ברמה אחת המולקולה. מולקולה בודדת המדידות של חלבון ספיחה על גבי משטח אורגניים וניתן לשנותם על ידי העסקת מערכים מקבילים של מצב מוצק nanopores. מערך מקביל של nanopores הכרחי בשל הצורך הנקבוביות assay רבים כדי לקבל נתון אמיןs. לשם כך, השימוש במערך nanopore תאפשר ניטור של adsorptions הפרט, כמו גם מדידה של מספר אירועים לניתוח נוסף. מערך של nanopores ב סיליקון ניטריד יכול להיווצר על ידי פרוטוקול הנ"ל פשוט על ידי קידוח חורים מרובים במדגם. Nanopore כל צריך להיות בסדר גודל דומה. מערכים של nanopores של 6x6 או 7x7 צריך להיות הולם. עם תוספת של אנליטי החלבון בתא, הזרם יתפרק באופן מעריכי עם הבעה הבאים:

אני _לא = אני _∞ - (אני _∞ - אני ₀₎ exp (-k t ")

הנה, אני _לא, מציין את הנוכחי לא זמן הניסוי. אני ₀ הוא חולף הנוכחית המקורי באמצעות מערך nanopore. _∞ אני מציין הנוכחי ברמת רוויה (כלומר, אינסוף). "K הוא שיעור ניכר מסדר ראשון התגובה תמידי, אשר יכול להיקבע בין הדואר להתאים עקומת הניסוי. K גדול "יכול להתפרש בקצב מהיר יותר ספיחה. יחס אני _∞ / אני _0, הנקרא גם את הרוויה מנורמל הנוכחי, הוא מספר מימדים בין 0 ל -1. פרמטר זה הוא מדד התפוסה על ידי analytes חלבון adsorbed. לכן, כל תנאי הניסוי ברורים צריך להיות מזוהה עם שני פרמטרים פלט ספציפי אני _∞ / I ₀ ו-k ".

יצוין, כי לכאורה מסדר ראשון קבועי קצב ספיחה וזרמים מנורמל מושפעים זמן יעיל בילה על ידי חלבונים בתוך nanopores. הפעם זה תלוי בריכוז של analytes חלבון בשלב מימית בתפזורת ^24. לכן, תיקון נוסף של המספרים האלה צריך להיות מיושם על בסיס זמן יעיל בילה על ידי חלבונים בתוך הפנים nanopore. אנו מציעים למדוד את התדירות של FASt (טרנסלוקציה) אירועים הכפלת זה בממוצע להתעכב זמן של אירועים כאלה. זה ייתן את הזמן הממוצע של חלבונים בילה בתוך הפנים nanopore ליחידת זמן.

שיעור קבוע של desorption ניתן לקבוע באמצעות מערך מקביל של nanopores גם כן. ברגע שהרמה הנוכחית מגיעה לרוויה (אני _∞), המתח צריך להיות הפוך, אז לא יותר חלבונים לכודים בתוך nanopores. Desorption של חלבונים בודדים ילווה שינוי של הנוכחי רשמה לערכים יותר. קבוע קצב יחולצו אז מעליית ברמה הנוכחית.

5.2 לאנגמיור קבוע ספיחה

קליטת analytes חלבון על גבי משטחים אורגניים של nanopores תלויה בריכוז החלבון בשלב מימית. תופעה זו כבר נצפו ברמת מולקולה בודדת ^13. אם θ מייצגים s הנוכחית הרוויה מנורמל (אני _∞ / I _0), אז משוואה לאנגמיור טיפוסי האיזותרמה ניתנת על ידי הביטוי הבא:

כאשר C הוא ריכוז חלבון בשלב מימית. α הוא לאנגמיור ספיחה מתמדת. זה מגדיל מתמיד עם עלייה אנרגיה המחייב של ספיחה עם ירידה בטמפרטורה. אוסף של נקודות נתונים θ יעסיק מדידות עם מערכים מקבילים שבוצעו בריכוזים שונים חלבון בשלב מימית. נתונים יש לנתח בשילוב עם טכניקות אחרות כדי לאמת את גודל קבוע מצויד לאנגמיור ספיחה. בנוסף, מלא atomistic סימולציות דינמיקה מולקולרית ^25,26 עשוי לשמש גם כדי לעזור פירושים של נתוני הניסוי שהתקבלו.

הכותרת "> 6. תוצאות נציג

תוצאות אופייניות של מצב מוצק nanopores יהיה כדלקמן. הנוכחי נקבוביות פתוחות צריך להיות מאוד יציבה, כפי שניתן לראות באיור. 4a. אני / V המאפיינים של nanopore צריך להיות ליניארי מאוד 1 M KCl, 10 פוספט אשלגן, pH 7.4, כפי שניתן לראות באיור. 2. שיפוע מתאים ליניארי עקומת I / V יספק המוליכות יחידתי של nanopore. המוליכות יש קשר ישיר לקוטר nanopore וצריך להתאים את המשוואה: שם G היא מוליכות של nanopore, d הוא הקוטר שלה, אני הוא באורך שלה, σ היא המוליכות של התמיסה בתא ^14. ערך זה צריך להתאים אל תוך 30%. אם זה קטן מדי, נקבוביות שלך סביר לא הרטובות. עם תוספת של חלבון, אירועים מהיר צריך להתחולל, כפי שניתן לראות באיור. 4b. Protעין ספיחה היא ירידה חיים ארוכים הנוכחית מוצגת באיור. 4c. חלבונים מסוימים מאוד יציב ולעבור השינוי המבני הפנימי בתוך הנקבוביות. במקרה זה, ירידה חיים ארוכים מתח ילווה תנודות מהירה.

באיור 1. מצב מוצק nanopore מפוברק באמצעות F20 Tecnai S / TEM. הנקבוביות נקדחה במצב גזע בקוטר של 20 ננומטר. התמונה צולמה במצב בהיר שדה TEM. Nitride היה 30 ננומטר עבה.

באיור 2. הקאמרית למגורים nanopore יחיד מצב מוצק ב-דופק התנגדות מידות. קאמרית) שבב סיליקון עם חלון שעמד חופשי ניטריד (רשת TEM). Nanopore הוא קדח לתוך ניטריד לפני הטעינה. רד O-טבעות משמשים כדי ליצור טובeal על השבב, המפריד בין שתי אמבטיות של פתרון יוניים. ב) סכמטי של החדר מראה מיקום של אמבטיות פתרון ואלקטרודות ביחס nanopore.

באיור 3. טיפוסי אני / V עקבות של מצב מוצק nanopores של קטרים ​​שונים. עקבות ערוץ יחיד חשמל צולמו 1 M KCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.5. Nanopores שנקדחו סיליקון ניטריד בעובי 30 ננומטר. ניטריד בעובי הערה תשפיע על המוליכות של יחידתי nanopore.

איור 4. נמדד יחיד ערוץ עקבות הנוכחית זיהוי של חלבון ספיחה.) זכר יחיד ערוץ חשמל מראה הנוכחי פתוח של nanopore בקוטר 10 ננומטר. ב) deflections נוכחי מייצגים חלוקה של אלבומין בסרום שור (BSA) אל ביןIOR של nanopore. ג) ספיחה של ארגון ה-BSA על פני השטח ניטריד. כל עקבות של nanopore זהה 1 M KCl, 10 mM אשלגן זרחתי, pH 7.4. הפוטנציאל הטרנסממברני מיושם היה 40 mV ו - BSA נוספה באמבטיה קאמרית מעוגנת בריכוז של 120 ננומטר.

דיון

ספיחה ספונטנית של חלבונים על מצב מוצק משטחים ^27-29 חשוב ביסודו במספר תחומים, כגון יישומים biochip ועיצוב של מעמד חדש של biomaterials היברידית תפקודית. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים adsorbed כדי מצב מוצק משטחים לא מראים הניידות לרוחב או שיעורי desorption משמעותי, ולכן חלבון ספיחה נחשבת בדרך כלל תהליך בלתי הפיך ולא ספציפי ^30-32. חלבון ספיחה על משטחים מצב מוצק נחשב בשל מספר גורמים, כולל כוחות אלקטרוסטטיים ו הידרופובי בין הרשתות בצד של חלבונים ושל קבוצות תגובתי ע...

חומרים

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Tecnai F20 S / TEM	פיי		S / TEM דורש מתח ההאצה ≥ מקור 200kV ואת פליטת שדה.
סיליקון בעובי 20 ננומטר ניטריד קרום חלון עבור TEM	SPI	4163SN-BA
אקסון Axopatch 200B-clamp תיקון מגבר	מולקולרית התקנים
אקסון Digidata 1440A	מולקולרית התקנים
pCLAMP 10 תוכנה	מולקולרית התקנים		Electrophysiology נתונים רכישת תוכנה וניתוח
חומצה גופרתית	Fisher מדעי	A300
מי חמצן	פישר סיינטיפיק	H325
O-טבעות סיליקון	מקמאסטר-קאר	003 S70	לחילופין להשתמש PDMS
חוט כסף	Sigma-Aldrich	348759	עבור אלקטרודות
SPC טכנולוגיה, D תת קשר, סיכת	ניוארק	9K4978	עבור אלקטרודות
אשלגן כלורי	סיגמא	P9541
אשלגן זרחתי dibasic	סיגמא	P2222
אשלגן זרחתי monobasic	סיגמא	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Elastomer סט. להכנת קאמרית.
Kwik-יצוקה איטום	העולם מכשירים Precision	KWIK-CAST	משחק מהיר סיליקון איטום
חם בצלחת	פישר סיינטיפיק
כלוב פאראדיי