$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. בידוד הנגזרות שומן גזע תאים (ASC)
הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
- לבודד את השומן עכברוש perirenal ו epididymal ולשטוף עם פתרון שנאגרו האנק של מלח סטרילית (HBSS) המכיל 1% בסרום שור עוברית (FBS) כפי שתואר קודם 6.
- לרכך את הרקמה ולהעביר 1-2 גרם בתוך 25 מ"ל של HBSS המכילים FBS 1% אל תוך צינור 50 מ"ל ו 500 גרם צנטריפוגות ב 8 דקות בטמפרטורת החדר.
- איסוף הספונטנית רקמת שומן שכבת והעברה בקבוק 125 מ"ל erlenmeyer ולטפל עם 25 מ"ל של collagenase מסוג II (200 יח' / מ"ל) ב HBSS 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (125 סל"ד).
- מוציאים בזהירות את החלק היחסי נוזלי (להלן נפט שכבת השומן) ולסנן ברצף דרך מסנן של 100 מיקרומטר ו 70 מיקרומטר רשת ניילון. בצנטריפוגה תסנין ב 500 גרם 10 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב supernatanלא לשטוף גלולה פעמיים עם 25 HBSS מ"ל.
- Resuspend תא גלולה ב 50 מ"ל של מדיום הגידול (MesenPRO בינוני RS בסל) השלימו עם תוספת RS צמיחה MesenPRO, אנטיביוטיקה antimycotic (100 U / mL של פניצילין G, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין סולפט מ"ל, ו -0.25 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B) , אל 2 T75 צלוחיות (25 מ"ל / בקבוק) 2 מ"מ L-גלוטמין ותאי pipet.
- תרבות ASC ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C (המעבר 2-4 ASC משמשים לניסויים בכלל).
2. הכנת Chitosan microspheres (CSM)
הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
- CSM מוכנים בתהליך תחליב מים בתוך שמן יחד עם הטכניקה coacervation יוניים באמצעות פרוטוקול הקודמת שלנו 6. Emulsify בתמיסה מימית של chitosan (6 מ"ל של chitosan 3% w / v בחומצה אצטית 0.5 מ ') 100 מ"ל של תערובת שמן השלב המורכב סויהשמן, N-octanol (01:02 v / v) ו 5% sorbitan-מונו oleate (פרק 80) מתחלב, באמצעות תקורה (1,700 סל"ד) ו בחישה מגנטי (1000 סל"ד) בו זמנית, בכיוונים מנוגדים. בשיטה הכפולה של ערבוב מבטיח כי micelles נוצרו בשלב מוקדם לפני cross-linking מתרחשת יכול להישאר פתרון ולא להסתפק לתחתית. יתר על כן, מערבבים המגנטי בר מסייע דה צבירה chitosan במהלך היווצרות micelle ו rigidization.
- התערובת היא עוררה ברציפות עד האמולסיה יציבה מים על שמן מתקבל במשך שעה בערך 1. Crosslinking יונית נשלחת עם תוספת של 1.5 מ"ל של הידרוקסיד 1% w / v אשלגן דקות N-octanol 15 עבור כל 4 שעות (24 מ"ל בסך הכל).
- לאחר השלמת התגובה crosslinking, למזוג לאט את השלב הנפט של CSM תערובת המכילה ומיד להוסיף את התחומים עד 100 מ"ל של אצטון. לשטוף את התחומים עם אצטון עד לשלב שמן נמחק לחלוטין.
- לייבש את התחומים התאוששה תא ייבוש ואקום אנאליyze ללא עיבוד נוסף. CSM הממוצע החלקיקים בגודל, שטח הפנים מיליגרם ו מעוקב יחידת נפח נקבע באמצעות גודל החלקיקים Analyzer.
- ניסויים שבאו לאחר מכן, לשטוף CSM שלוש פעמים עם מים סטריליים כדי להסיר שאריות מלחי ו לחטא עם אלכוהול מוחלט.
3. קביעת מספר קבוצות אמינו חופשיות ב CSM
הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
- לקבוע את מספר קבוצות אמינו חופשיות הנמצאים CSM לאחר crosslinking יוניים באמצעות benzenesulfonic trinitro (TNBS) assay של חומצה Bubins ו Ofner 7. דגירה של 5 מ"ג microspheres עם 1 מ"ל של תמיסת TNBS 0.5% בשנת צינור זכוכית 50 מ"ל במשך 4 שעות ב 40 מעלות צלזיוס, hydrolyze עם תוספת של 3 מ"ל של HCl 6N ב 60 ° C ל 2h.
- לקרר את דגימות לטמפרטורת החדר, ולחלץ את TNBS בחינם על ידי הוספת 5 מ"ל מים deionized ו 10 מ"ל של אתילהאתר.
- לחמם aliquot 5 מ"ל של שלב מימית עד 40 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות להתאדות בכל האתר שיורית, מצננים לטמפרטורת החדר, לדלל עם 15 מ"ל מים.
- למדוד את ספיגת ב 345 ננומטר עם ספקטרופוטומטר באמצעות פתרון TNBS ללא chitosan כמו ריק chitosan משמש להכנת CSM כדי לקבוע את המספר הכולל של קבוצות אמינו. להעריך את מספר קבוצות אמינו חופשיות של CSM ביחס chitosan.
4. טוען ASC ב CSM
הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
- לאזן 5 מ"ג של CSM עיקור מסעיף 2.5 ב HBSS סטריליים לילה ולהוסיף 8-מיקרומטר גודל הנקבוביות להוסיף קרום צלחת תרבות (24 גם צלחת).
- לאחר CSM התיישבו על הממברנה, בזהירות לשאוב את HBSS ולהוסיף 300 μL של מדיום הגידול הפנימי של הכנס ו 700 μL של התקשורת הצמיחה ל הדואר מחוץ להוסיף.
- Resuspend ASC בריכוז המתאים (1 x 4-04 אוקטובר 10 x 4) 200 μL של המדיום צמיחה זרע על CSM בתוך להוסיף את הצלחת התרבות. היקף הסופי של המדיום תוך הוספה התרבות, לאחר זריעה, הוא 500 μL.
- דגירה seeded ASC על CSM עבור H 24 ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C.
5. קביעת אחוז טוען ASC ו כדאיות התא ב CSM
הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
- לאחר הדגירה, לאסוף CSM ASC-טעון צינור 1.5-מ"ל סטרילי microcentrifuge מבלי להפריע את התאים אשר היגרו אל קרום הוספה.
- להסיר את שאריות בינוני ומוסיפים 250 μL של מדיום הגידול טרי הצינור.
- אל צינור זה להוסיף 25 MTT μL [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד]הפתרון (5 מ"ג / מ"ל) ו - דגירה של 4 שעות ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C.
- לאחר הדגירה, הסר בינוני, מוסיפים 250 μL של sulfoxide דימתיל, ואת המערבולת התערובת במשך 2-5 דקות כדי solubilize מורכבת formazan.
- בצנטריפוגה CSM ב 2700 x g 5 דקות, ולקבוע את ספיגת supernatant נמדד ב 570 ננומטר באמצעות 630 ננומטר כנקודת התייחסות.
- לקבוע את מספר הסלולרי קשור CSM יחסית לערך ספיגת לקבל מספרים הידועים של ASC בת קיימא.
6. אפיון ASC-CSM-Embedded קולגן ג'ל
הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
- מערבבים ASC-CSM טעון (5 מ"ג המכיל ≈ 2 x 10 4 תאים) עם קולגן סוג 1 (7.5 מ"ג / מ"ל) המופק גיד זנב עכברוש על פי השיטה של בורנשטיין 8 ו לרעוד לאחר התאמת נתוני pH 6.8 כדי שימוש 2 N NaOH. מוסיפים את תערובת פירפר קולגן-ASC-CSM לצלחת 12-טוב ו דגירה של 30 דקות בשעה של 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C.
- לאחר פרפור מלאה, דגירה של קולגן-ASC-CSM ג'ל של עד 14 יום ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C.
- שחרור והעברה של תאים CSM לתוך הג'ל נצפו באמצעות שיטות מיקרוסקופיה רגילות.
7. נציג תוצאות
במחקר הנוכחי, פיתחנו אסטרטגיה במבחנה כדי לספק לתאי גזע של chitosan microspheres (CSM) לתוך קולגן ג'ל הפיגום. CSM נקבובי בגודל אחיד (175-225 מיקרומטר קוטר) והרכב היו מוכנים ושימש ספקים סלולריים (איור 2). על דוגרים ASC עם CSM, התאים מחוברים בריכוז של 2 cells/5mg x 4 10 של CSM. התאים מסוגלים להתפשט על microsphere, תוך הארכת filopodiaלתוך הסדקים נקבוביים של microsphere (איור 3). לאחר CSM התא טעון היו מעורבים עם ג'ל קולגן, התאים החלו מיד נודדות אל ג 'ל (איור 4).
טבלה 1. יתרונות ביולוגיים לשימוש של chitosan ו הקולגן מערכת תא גזע הלידה.
באיור 1. סכמטי המתאר את האסטרטגיה הכוללת לשימוש כפול של ASC-CSM פיגומים טעון קולגן. איורים 2, 3 ו -4 הם המבואר בתוך סכמטי לסייע בפרשנות של התמונות.
איור 2. ייצוג סכמטי המתאר את תהליך זריעת בתאי גזע על chitosan microspheres. ProcESS כוללת שיתוף culturing ASC עם CSM ב 8 - נקבוביות מיקרומטר בגודל הממברנה התרבות להוסיף צלחת. לאחר 24 שעות, microspheres יוסרו להוסיף והם מוכנים להטבעת לתוך המטריצה בחומר ביולוגי.
איור 3. אפיון מורפולוגי של CSM-עמוסה ASC. לוח מתאר מיקרוסקופ אור של CSM ASC טעונים, בעוד לוח ב 'מראה את אותו שדה הראייה גבי בתמונה מתקבל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ASC היו מראש עם calcein בבוקר (ירוק). לוח ג מתאר תמונה של תמונה SEM של microsphere פרקו, בעוד לוח ד ניתן לראות תאים הועמסו על microsphere (כוכביות). תמונת TEM ב E לוח מראה חתך של microsphere טעון. מספר רב של נקבוביות הסדקים נמצאים ברחבי microsphere. לוח F מראה microsphere בחתך רוחב עם תאים (חיצים) מחובר הארכת filopodia אל creהמידות הרעות. בהגדלה מקור: & B = 70x, C = 500X, D = 2000 x, E & F = 2,500 x.
איור 4. הגירה של ASC מ CSM לתוך תלת מימדי קולגן הפיגום. לוחות א 'וב' מתארים CSM עם תאים נודדות הרחק microsphere לתוך המטריצה קולגן ביום 3 (א ', חיצים). לוח ב 'מציג את התרבות דומה לאחר 12 יום. מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) תמונות מתוארים ג', ד ', וא' כוכביות ב-C ו-D להראות microsphere כי כבר בחתך רוחב עם תאים נודדות הרחק microsphere (חיצים). ההגדלה גבוה יותר של לוח ד מתואר E לוח, ומראה filopodia התא מחוברת את סיבי הקולגן (השיבוץ). ההגדלה המקורי: A ו-B = 100x: C & D = 6000 x, E = 20,000 X, הבלעה = 150000 x.
איור 5.סכמה המתארת את השימושים עצומות של CSM ברפואה רגנרטיבית משלוח סמים.