זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה חדשה לייצור וטיהור הבאות של ובתאים עצביים ממקורות מתחדשים בתאי גזע עצביים (NSCs) מבוסס על (גרעיניות בגודל פנימי) הפיזי שלהם תכונות ניאון cytometry באמצעות טכנולוגיית הזרימה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתאי גזע עצביים (NSCs) יכול להיות מבודד והוא התרחבה בקנה מידה גדול, תוך שימוש assay neurosphere הבדיל אל שלושת סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כלומר, האסטרוציטים, oligodendrocytes נוירונים. תכונות אלו הופכות את גזע עצביים ו ובתאים מקור רב ערך מתחדשת של תאים במבחנה כגון הקרנת סמים, neurotoxicology ו electrophysiology וכן טיפול בתאי החלפת במחלות נוירולוגיות רבות. בפועל, עם זאת, ההטרוגניות של הצאצאים המל"ל, ייצור נמוך של נוירונים oligodendrocytes, ואת השליטה של האסטרוציטים הבאים בידול להגביל יישומים קליניים שלהם. כאן אנו מתארים מתודולוגיה חדשנית לטיהור הדור הבא של נוירונים בוגרים של הצאצאים המל"ל Murine באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS) הטכנולוגיה. באמצעות מתודולוגיה זו, האוכלוסייה העשירה ביותר העצבית תא אבי ניתן להשיג שנינותHout כל astrocyte בולט וזיהום בתום לב המל"ל. ההליך כולל בידול של הצאצאים המל"ל מבודד והרחיב מ E14 יואילו הוד עכבר ganglionic באמצעות assay neurosphere, ואחריו בידוד והעשרה של תאים לא מפותחים על בסיס תכונות פיזיות (גודל ומורכבות פנימית) ו פלורסנט שלהם באמצעות טכנולוגיית הזרימה cytometry. בסך הכל, זה לוקח 5-7 ימים לייצר neurospheres ו 6-8 ימים כדי לבדל את הצאצאים המל"ל ולבודד מטוהרים מאוד תאים עצביים מפותחים.
פרוטוקול
1. יסוד הגדרת לפני שתמשיך תרבית תאים
- NeuroCult בינוני המל"ל הבסיס, NeuroCult המל"ל תוספי הפצת נשק מעורבבים ביחס של 09:01, בהתאמה, כדי להשלים בינוני המל"ל.
- 37 ° C אמבט מים משמש להתחמם בינוני.
- הכמות המתאימה של חום מומת העובר עגל בסרום (FCS) הינו מופשר.
- הכמות המתאימה של צמיחה מניות פתרונות גורם לרבות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF על 10 מיקרוגרם / מ"ל), הצמיחה הבסיסית גורם fibroblastic (ב-FGF על 10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היכולת לבודד המוגדרים אוכלוסיות תאים עצביים (כלומר נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes) עשוי לפתור חלק מן המכשולים הקשורים ליישום קליני בתאי גזע עצביים (NSCs). ראשית, הוא מאפשר לנו לאפיין באופן מלא את האוכלוסייה המוצא של התאים התורמות. שנית, היא מאפשרת לנו להשתמש בסוג תא מסוים או שילוב של סוגי תאים שונים עם יחס מסוים, בהתאם לאופי או שלב המחלה. לבסוף, באמצעות מועשר מראש הבדיל אבות תאים עצביים יכול להקטין באופן משמעותי את התפשטות בלתי מבוקרת האפשר היווצרות הגידול קשור באמצעות מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם מגיב | סוג | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| NeuroCult המל"ל בסל בינוני | בינוני | גזע התא טכנולוגיות | 05700 | |
| NeuroCult המל"ל הפצת נשק תוספי | בינוני תוספת | גזע התא טכנולוגיות | 05701 | |
| % 0.05-EDTA טריפסין | מגיב | Gibco | 25300-062 | |
| טריפסין סויה מעכב | מגיב | סיגמא | T6522 | |
| פן / סטרפטוקוקוס | מגיב | Gibco | 15140-122 | |
| * MEM | מגיב | Gibco | 41500-018 | Hem רכיב |
| * Quick HEPES | מגיב | סיגמא | H4034 | Hem רכיב |
| * מים מזוקקים | מגיב | Gibco | 15230-147 | |
| תא מסננת | כברה | BD פלקון | 352340 | |
| T25 הבקבוק | תרבות כלי | Nalge Nunc הבינלאומי | 136196 | |
| T80 הבקבוק | תרבות כלי | Nalge Nunc הבינלאומי | 178905 | |
| 15 מ"ל צינורות | תרבות כלי | BD פלקון | 352096 | |
| 50 מ"ל צינורות | תרבות כלי | BD פלקון | 352070 | |
| EGF | גורם הגדילה | R & D | 2028-EG | |
| ב-FGF | גורם הגדילה | R & D | 3139-FB | |
| הפרין | גורם הגדילה | סיגמא | H4784 | מחדש ב PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | נוגדן | Miltenyi BIOTEC | 130-093-274 | |
| PE-מצומדות העכבר IgG1 | Isotype נוגדנים השליטה | BD Pharminogen | 556029 | |
| הפרין | גורם הגדילה | סיגמא | H4784 | מחדש ב PBS |
| HrBMP-4 | גורם הגדילה | R & D | 314-BP-010 | |
| פולי-L-אורניתHine | מגיב | סיגמא | P4957 | |
| עגל עוברית סרום | בינוני מוסף | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | נוגדן | DAKO | Z0334 | |
| B-III טובולין | נוגדן | Promega | G7121 |
* כדי להפוך, Hem תערובת 1 x 10 L חבילת MEM ו 160 מ"ל של 1M HEPES ולהביא נפח 8.75 ל 'באמצעות מים מזוקקים. הגדר את PH הסופי 7.4 ולאחסן אותו ב 4 ° C.
מקורות
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
