Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

סיכום

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה חדשה לייצור וטיהור הבאות של ובתאים עצביים ממקורות מתחדשים בתאי גזע עצביים (NSCs) מבוסס על (גרעיניות בגודל פנימי) הפיזי שלהם תכונות ניאון cytometry באמצעות טכנולוגיית הזרימה.

תקציר

בתאי גזע עצביים (NSCs) יכול להיות מבודד והוא התרחבה בקנה מידה גדול, תוך שימוש assay neurosphere הבדיל אל שלושת סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כלומר, האסטרוציטים, oligodendrocytes נוירונים. תכונות אלו הופכות את גזע עצביים ו ובתאים מקור רב ערך מתחדשת של תאים במבחנה כגון הקרנת סמים, neurotoxicology ו electrophysiology וכן טיפול בתאי החלפת במחלות נוירולוגיות רבות. בפועל, עם זאת, ההטרוגניות של הצאצאים המל"ל, ייצור נמוך של נוירונים oligodendrocytes, ואת השליטה של ​​האסטרוציטים הבאים בידול להגביל יישומים קליניים שלהם. כאן אנו מתארים מתודולוגיה חדשנית לטיהור הדור הבא של נוירונים בוגרים של הצאצאים המל"ל Murine באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS) הטכנולוגיה. באמצעות מתודולוגיה זו, האוכלוסייה העשירה ביותר העצבית תא אבי ניתן להשיג שנינותHout כל astrocyte בולט וזיהום בתום לב המל"ל. ההליך כולל בידול של הצאצאים המל"ל מבודד והרחיב מ E14 יואילו הוד עכבר ganglionic באמצעות assay neurosphere, ואחריו בידוד והעשרה של תאים לא מפותחים על בסיס תכונות פיזיות (גודל ומורכבות פנימית) ו פלורסנט שלהם באמצעות טכנולוגיית הזרימה cytometry. בסך הכל, זה לוקח 5-7 ימים לייצר neurospheres ו 6-8 ימים כדי לבדל את הצאצאים המל"ל ולבודד מטוהרים מאוד תאים עצביים מפותחים.

פרוטוקול

1. יסוד הגדרת לפני שתמשיך תרבית תאים

1. NeuroCult בינוני המל"ל הבסיס, NeuroCult המל"ל תוספי הפצת נשק מעורבבים ביחס של 09:01, בהתאמה, כדי להשלים בינוני המל"ל.
2. 37 ° C אמבט מים משמש להתחמם בינוני.
3. הכמות המתאימה של חום מומת העובר עגל בסרום (FCS) הינו מופשר.
4. הכמות המתאימה של צמיחה מניות פתרונות גורם לרבות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF על 10 מיקרוגרם / מ"ל), הצמיחה הבסיסית גורם fibroblastic (ב-FGF על 10 מיקרוגרם / מ"ל) פתרון הפרין 0.2% ב פוספט בופר סליין (PBS) הם הפשירו.
5. תרביות רקמה צלוחיות (T25, T75 או & T175) יש צורך להרחבת המל"ל והבחנה.
6. תרביות רקמה טיפול 96 ו 24 צלחות גם וגם coverslips זכוכית יש צורך ציפוי תאים ממוינים.

2. , בידוד הרחבה (Passaging) של NSCs

1. גזע עצביים ואת אבות מבודדים והרחיב של העכבר בגשם כמתואר פרוטוקולים נפרדים ^{1, 2 3.}
2. כאשר neurospheres (neurospheres ראשוניים או passaged) מוכנים תת (150-200 מיקרומטר קוטר), הכדורים המכילים בינוני מועבר צינור סטרילי המתאים לגודל רקמות תרבות, centrifuged על 800 סל"ד (110 גרם) במשך 5 דק ' בטמפרטורת החדר.
3. בינוני supernatant יוסר בתחומים אלה מחדש תלויה מ"ל 1 של 0.05% מחומם מראש טריפסין-EDTA.
4. לאחר דגירה של 37 C ° אמבט מים במשך 2-3 דקות, נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה מתווסף ההשעיה התא להפסיק את פעילות טריפסין.
5. על מנת להבטיח כי טריפסין כבר לחלוטין בלתי פעיל, ההשעיה התא pipetted בעדינות מעלה ומטה 3-5 פעמים.
6. לאחר צנטריפוגה על 800 סל"ד (110 גרם) של 5 דקות, supernatant מוסר ואת התאים מחדש תלויה מ"ל 1 של המדיום המל"ל מלאה.
7. 10μl ההשעיה של התא הוא מעורבב עם 90 μl של trypan כחול לבצע ספירת תאים.
   הערה: דילולים סלולריים אחרים המתאימים יכול לשמש גם.
   
8. התאים משמשים עבור תת ^{1, 2} או בידול כמתואר להלן.

3. דיפרנציאציה של גזע עצביים ו ובתאים, Assay Neuroblast (NBA)

1. תאים כתוצאה neurospheres הסתייגותם הם מצופה בריכוז של 2-3 x 10 ⁵ תאים / מ"ל במדיום המל"ל מלאה בתוספת 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, μl 1 / מ"ל הפרין 0.2% ו 5% החום מובטל FCS ב הבקבוק בגודל המתאים רקמת התרבות. 5 מ"ל בינוני משמש מ"ל 20 T25, T75 ו עבור 40 מ"ל של T175 צלוחיות.
   הערה: FCS יגרום התאים היטב לצרף למצע ואין צורך לציפוי צלוחיות לתרבות ה-NBA.
   
2. פולחןצלוחיות יור מודגרת מכן עם CO 5% ₂ ל 3-4 ימים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified. תקופה זו נקראת שלב התפשטות, שבמהלכו הצאצאים המל"ל לצרף המצע מתרבים כמו monolayer של תאים.
3. כאשר התרבות הופכת confluent 90-95%, המדיום של כל בקבוק הוא עבר בינוני המל"ל שלם השלימו עם FCS 5% ללא כל גורמי גדילה.
4. צלוחיות תרבות מודגרת שוב עם CO 5% ₂ במשך 3-4 ימים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified. תקופה זו נקראת שלב התמיינות, שבהם אבות עצביים להופיע מעל monolayer astrocytic מתרבים לעשות מושבות של תאים בוגרים. ביום 4-5 שלב התמיינות, תרבות מוכן בידוד של תאים neuroblast cytometry באמצעות טכנולוגיית הזרימה.

4. תא הכנה cytometry זרימה

Trypsiniלאספקת

1. תרבות להבדיל הצאצאים המל"ל ביום 4-5 של שלב הבידול הוא שטף פעם אחת עם כמות מתאימה של PBS (2 מ"ל של T25, T75 של 4 מ"ל ו - 8 מ"ל עבור בקבוק T175) להסיר FCS מתרבות.
   הערה: בלוקים FCS טריפסין-EDTA פעילות.
   
2. לאחר מכן, כמות מספקת של 0.05% מחומם מראש טריפסין-EDTA (2 מ"ל של T25, T75 של 4 מ"ל ו - 8 מ"ל עבור בקבוק T175) מתווסף בקבוק אחד כדי לכסות את monolayer תא מודגרות דקות ב 1-2 37 ° C חממה humidified.
3. בקבוק נבדק תחת מיקרוסקופ על מנת להעריך את ההשפעה של טריפסין-EDTA על התרבות. הבקבוק מוחזק ואז ביד אחת פגעה בחוזקה ביד השנייה כדי לסלק את התאים מן החלק התחתון של הבקבוק.
4. נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה מתווסף הבקבוק כדי להרוות את פעילות טריפסין. ההשעיה התא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדי להבטיח איון טריפסין ולהשיג תא בודד הומוגניתההשעיה.
   הערה: לחלופין, המדיום השלימו עם FCS 5% יכול לשמש כדי להרוות את פעילות טריפסין.
   
5. כדי להסיר אי - הסתייגותם גושים, ההשעיה התא עובר דרך המסנן של 40 מיקרומטר בגודל הרשת.
6. ההשעיה התא centrifuged אז 800 סל"ד (110g) עבור 5 דקות, supernatant מוסר ואת התאים מחדש תלוי בנפח בינוני המתאים של המל"ל מלאה.
7. נפח הסופי של השעיה התא הוא מותאם כך צפיפות התאים אינו עולה על 2-3x10 ⁶ -cells/ml. צפיפות התאים גבוהה עלול לגרום לחסימת זרם במכונה cytometry הזרימה.
8. אם אתה רוצה לבודד תאים עצביים המבוססים רק על תכונות פיזיות שלהם, עכשיו אתה יכול להמשיך FACS מיון כפי שתואר בחלק 4.
9. לפני מיון, יודיד Propidium (PI, Sigma, 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS) נוסף בריכוז של μl 1 / מ"ל ​​של תרחיף תאים שלא לכלול תאים מתים.

חיים celאני immunolabeling

כדי להשיג את הטוהר גבוהה יותר של תאים עצביים, שנקטפו תא בודד מתרבות ה-NBA יכול להיות מוכתם עבור PSA-NCAM (סמן של המוקדמות אבות עצביים מפותחים) ולאחר מכן את התאים חיוביות של האוכלוסייה עצבי ניתן לבודד באמצעות מכונת FACS.

1. לאחר ביצוע ספירת תאים, ההשעיה תא בודד מתרבות ה-NBA מחולק לארבע קבוצות:
   • תאים בלבד הקבוצה, משמש פקד כדי להתאים את הפרמטרים ושערים (0.5-1 x 10 ⁶ תאים).
   • תאים בתוספת לצרכן, משמש פקד כדי להתאים את הפרמטרים ושערים (0.5-10 x 10 ⁶ תאים). התאים לצרכן שליליות מקבוצה זו ניתן גם ממוינים לפי המאפיינים תאים פיזיים.
   • משני בלבד (בקרת Isotype) הקבוצה משמשת גם פקד כדי להתאים את הפרמטרים ושערים (1-2 x 10 ⁶ תאים).
   • Immunolabeling הקבוצה (8-10 x 10 ⁶ תאים), כי הוא מוכתם עבור PSA-NCAM להשיגטיהור נוסף של תאים עצביים מפותחים. כדי לא לכלול תאים מתים על גבי מיון, PI נוסף לקבוצה זו גם כן.
2. כדי להתחיל immunolabeling, תאים centrifuged ב -800 סל"ד (110 גרם) עבור 5 דקות. Supernatant מוסר ואת התאים מחדש תלויה μl 100 של המל"ל בינוני מלא.
3. Phycoerythrin (PE) מצומדות נוגדנים נגד ה-PSA-NCAM נוסף ביחס של 10 μl / 5-10 x 10 ⁶ תאים ההשעיה התא להיות מוכתם עבור PSA-NCAM. באותו אופן, מצומדות PE IgG1 העכבר isotype נוגדנים השליטה מתווסף השעיה מלאה isotype התא. בצע את ההוראות בגיליון נוגדנים מפרט לגבי הריכוז של נוגדנים לשמש. ההשעיה התא הוא מעורב אז בעדינות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות בחושך.
4. את המתלים סלולריים (PSA-NCAM וצינורות Isotype בקרה) הם centrifuged אז 800 סל"ד (110 גרם) 5 דקות, supernatant יוסר התאים מחדש suspended ב 1 מ"ל של מדיום המל"ל מלאה.
5. כדי להסיר עודף בלתי המאוגדות נוגדנים מן הדגימות, 4 שלב חוזר על עצמו 2-3 פעמים.
6. אחרי השעיית מחדש תאים בהיקף של המדיום המתאים, יודיד Propidium (PI, Sigma, 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS) נוסף בריכוז של 1 מ"ל / μl של תאים המתלים (תאים בתוספת לצרכן, isotype מלאה PSA- NCAM המוכתמים דגימות) שלא לכלול תאים מתים כאשר נותחו על ידי cytometry הזרימה.
7. 15 מ"ל סטריליים המכילים צינורות בז 1 מ"ל של מדיום מלאה מוכנים לאסוף תאים ממוינים של אוכלוסיות תאים שונות.

5. הקרינה המופעל Cell מיון (FACS) של נוירונים לא מפותחים

1. מכונת FACS מוגדר על פי הוראתה הוראות שימוש באמצעות טכנאי cytometry זרימת מתקן מומחה.
2. פוספט בופר סליין (PBS) או כל dependin אחר פתרון הולםg על הוראות היצרן, יכול לשמש נוזל נדן ב 28 PSI דרך נחיר 90 מיקרומטר.
3. לחץ דיפרנציאלי במערכת מותאם כך ששיעור ההדק מין אינו עולה על 2,500 אירועים / שנייה.
4. ההשעיה תא מתאי בלבד הקבוצה מנוהלת באמצעות מכונת FACS.
5. ראשית, התאים (אירועים) נרשמות על פי גודלם (פיזור אור קדימה (FSC)) לעומת המורכבות הפנימית (פיזור סייד (SSC) אור) כדי להבחין בין אוכלוסיות תאים שונות. כדי לעשות זאת, פרמטרים מתח עבור FSC ו SSC צריך להיות מותאם כך התאים ניתן לראות בעלילה cytometry הזרימה.
6. כדי לא לכלול גושים סלולריים כפילויות, התאים 1 זממו על שטח פיזור קדימה (FSC-) לעומת פיזור קדימה הדופק רוחב (FSC-W) לבין האוכלוסייה תא בודד היא מגודרת כאוכלוסייה 1 (P1). לאחר מכן התאים P1 נרשמות על בסיס השטח בצד פיזור (SSC-) לעומת פיזור לצד הדופק רוחב (FSC-W) והפעם על תאים בודדים הם גתאד כאוכלוסייה 2 (P2). לאחר שקבע שני שערים רצופים, גושים או כפילויות (FSC גבוהה רוחב הדופק גבוה רוחב הדופק SSC) נמצאים מחוץ לתחום.
7. כדי לא לכלול תאים מתים או פגומים, התאים בודדים (P2) נרשמות על בסיס תגובתיות לצרכן לעומת FSC-והאוכלוסייה אחת תא חי הוא מגודרת.
8. תאים חיים בודדים נרשמות על בסיס FSC מול SSC להבחין בין אוכלוסיות תאים שונות על בסיס גודל התא גרעיניות פנימי. בשלב זה שתי אוכלוסיות התאים העיקריים הם מגודרת כמו FSC ^נמוכה SSC ^נמוכה (P3) ו FSC ^גבוהה SSC ^גבוהה (P4) אוכלוסיות תאים.
9. כדי למיין PSA-NCAM חיסונית תגובתי תאים עצביים מפותחים של האוכלוסייה ^נמוכה SSC FSC ^נמוכה, 1 FSC אוכלוסייה ^נמוכה SSC ^נמוך מ השליטה (תאים בתוספת לצרכן ו isotype שליטה) קבוצות הוא זמם על immunoreactivity PE לעומת FSC-A ו-שלילי התאים הם מגודרת (P5) ולאחר מכן התאים חיוביות של PSA-NCAMהקבוצה הצבעונית הם מגודרת כמו האוכלוסייה 6 (P6).
10. לאחר התאמת כל השערים הדרושים, תאים של האינטרסים מסודרים ל -15 מ"ל סטריליים תרבות צינורות המכילים רקמות בינוני 1ml המל"ל.
11. תאים ממוינים אלה centrifuged מכן ב 1200 סל"ד (240 גרם) עבור 5 דקות.
12. Supernatant נמחק ו גלולה מחדש תלוי בנפח המתאים בינוני (תלוי בגודל גלולה) ואת מספר התא מתבצע.
13. תאים מצופה מכן בצפיפות של 20-30 x 10 תאים ³ / μl 200-250 היטב של המדיום המל"ל מלא פולי-L-96-ornithine גם צלחות מצופה FCS 5% ו - 20 ng / ml האדם רקומביננטי BMP4 ⁵ .

הערה: כדי לצפות 96 בארות, 100 μl של פתרון העבודה פולי-L-ornithine (1.5 מ"ל פולי-O ו -8.5 מ"ל של PBS סטרילית) מתווסף כל היטב את הצלחת הוא מודגרות ב 37 ° C חממה לפחות 1 שעה. לאחר מכן, פולי-O מוסר וכל אחד גם הוא שטף שלוש פעמים עם PBS סטרילית(שלא PBS להישאר גם 10 דקות בכל פעם). השתמש 500 μl של פולי-L-ornithine עובדים פתרון / גם אם 24 גם צלחות משמשים.

14. תאים מקובעים אז לאחר המיון באמצעות paraformaldehyde 4% קר בנקודות זמן שונות immunostained עבור המתאימים תאים עצביים סמנים ו גליה להעריך את הפנוטיפ של תאים ממוינים של אוכלוסיות תאים שונות.

6. נציג תוצאות

בשנת תרבות assay neuroblast בידול (NBA), תאים מצופה לצרף המצע תרבות רקמות לגדול ככל monolayer. בהתאם צפיפות התאים הראשונית ציפוי, התרבות תהפוך לתרבות confluent 90-95% אחרי 3-4 ימים. בשלב זה, בעיקר monolayer של תאים astrocytic יכול להיות מתחת דמיינו עם תאים קטנים עגולים אב עצביים על ^4,5 העליון (איור 1). לאחר המעבר בינוני עד בינוני גורם הגדילה בחינם, ובתאים עצביים להתחילחלוקת במהירות וליצור אשכולות של תאים neuroblast מפותחים על גבי monolayer astrocytic בימים 4-5 (איור 2). Cytometry זרימה ניתוח של תרבות ה-NBA ניתק ביום 4-5 שלב התמיינות, מראה שתי אוכלוסיות התאים העיקריים; FSC ^נמוכה SSC ^נמוכים FSC SSC ^{גבוהה גבוהה} על בסיס גודל התא (FSC) ו גרעיניות פנימיות (SSC) (איור 3). חיסוני ניאון ניתוח של תאים ממוינים מראה כי תאים עצביים נמצאים בעיקר אוכלוסיות FSC ^נמוכות SSC ^נמוכות (עם יותר מ 75% מהם להביע β-III טובולין), בעוד תאים ממוינים מן האוכלוסייה ^גבוהה SSC FSC ^גבוהה הם ברובם GFAP האסטרוציטים immunoreactive (איור 4). טיהור נוסף של תאים לא בשלים עד הומוגניות הקרוב (97%) ניתן להשיג עם מבחר החיובי של PSA-NCAM תאים אינפרא אדום מן האוכלוסייה ^נמוכה SSC FSC ^נמוכה (איור3, 4). תאים עצביים מועשר שנוצר משימוש NSCs מבודד E14 יואילו הוד עכבר ganglionic לרכוש פנוטיפ GABAergic ולהביע DARPP-32, סמן של נוירונים קוצניים בינוני, על התמיינות (איור 5).

1. איור Neuroblast assay תרבות מ E14 עכבר לתאי גזע עצביים ביום 4 של שלב ההפצה. זו תרבות monolayer מכיל תאים astrocytic שטוח (ראשי חץ) מתחת ו עגולים ובתאים עצביים (חיצים) על העליונה. ההגדלה המקורי, 20 x.

2. איור Neuroblast assay תרבות מ E14 עכבר לתאי גזע עצביים ביום 4 של שלב התמיינות: בניגוד) שלב ', ב') צביעה Immunofluorescent. שים לב לאשכול של תאים לא מפותחים (חיצים ב ng> ו β טובולין מכתים III ב ') על גבי monolayer astrocytic (ראשי החצים ב מכתים GFAP, ב'). ההגדלה המקורי, 20 x.

. איור 3 נציג מגרשים מיון:). FSC לעומת העלילה SSC מין לפני הוצאת כפילויות ותאים מתים. B, C). מיין חלקות עבור הוצאת כפילויות על בסיס FSC ו SSC רוחב הדופק. ד). הרחקה של תאים מתים פגום בהתבסס על immunoreactivity יודיד Propidium. E). FSC מול SSC העלילה בניכוי כפילויות ותאים מתים, מראה שתי האוכלוסיות העיקריות שכותרתו ^נמוכה FSC SSC ^נמוכה ואת ^גבוה FSC אוכלוסיות SSC ^{גבוהים.} F, G). מגרשים מיין לבודד PSA-NCAM תאים אינפרא אדום בשלה מן האוכלוסייה FSC SSC ^{נמוך נמוך.}

התחת = "jove_content">
באיור 4. Micrographs נציג של תאים ממוינים מאוכלוסיות שונות, יום אחד לאחר ציפוי.) FSC ^נמוכה האוכלוסייה SSC ^נמוכה (יותר מ 75% של תאים אלה הם נוירונים). ב ') FSC ^גבוהה האוכלוסייה SSC ^גבוהה (רוב של תאים אלה הם האסטרוציטים ). C) PSA-NCAM ⁺ תאים ממוינים מן האוכלוסייה FSC SSC ^{נמוך נמוך} (כמעט כל התאים הממוינים הם נוירונים). הגדלה המקורי, 20 x.

באיור 5. נוירונים בוגרים ממוין להתמיין נוירונים GABAergic (א ') ולהביע DARPP-32 (B), סמן נוירונים קוצניים בינוני.

דיון

היכולת לבודד המוגדרים אוכלוסיות תאים עצביים (כלומר נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes) עשוי לפתור חלק מן המכשולים הקשורים ליישום קליני בתאי גזע עצביים (NSCs). ראשית, הוא מאפשר לנו לאפיין באופן מלא את האוכלוסייה המוצא של התאים התורמות. שנית, היא מאפשרת לנו להשתמש בסוג תא מסוים או שילוב של סוגי תאים שונים עם יחס מסוים, בהתאם לאופי או שלב המחלה. לבסוף, באמצעות מועשר מראש הבדיל אבות תאים עצביים יכול להקטין באופן משמעותי את התפשטות בלתי מבוקרת האפשר היווצרות הגידול קשור באמצעות מ...

חומרים

שם מגיב	סוג	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
NeuroCult המל"ל בסל בינוני	בינוני	גזע התא טכנולוגיות	05700
NeuroCult המל"ל הפצת נשק תוספי	בינוני תוספת	גזע התא טכנולוגיות	05701
% 0.05-EDTA טריפסין	מגיב	Gibco	25300-062
טריפסין סויה מעכב	מגיב	סיגמא	T6522
פן / סטרפטוקוקוס	מגיב	Gibco	15140-122
* MEM	מגיב	Gibco	41500-018	Hem רכיב
* Quick HEPES	מגיב	סיגמא	H4034	Hem רכיב
* מים מזוקקים	מגיב	Gibco	15230-147
תא מסננת	כברה	BD פלקון	352340
T25 הבקבוק	תרבות כלי	Nalge Nunc הבינלאומי	136196
T80 הבקבוק	תרבות כלי	Nalge Nunc הבינלאומי	178905
15 מ"ל צינורות	תרבות כלי	BD פלקון	352096
50 מ"ל צינורות	תרבות כלי	BD פלקון	352070
EGF	גורם הגדילה	R & D	2028-EG
ב-FGF	גורם הגדילה	R & D	3139-FB
הפרין	גורם הגדילה	סיגמא	H4784	מחדש ב PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	נוגדן	Miltenyi BIOTEC	130-093-274
PE-מצומדות העכבר IgG1	Isotype נוגדנים השליטה	BD Pharminogen	556029
הפרין	גורם הגדילה	סיגמא	H4784	מחדש ב PBS
HrBMP-4	גורם הגדילה	R & D	314-BP-010
פולי-L-אורניתHine	מגיב	סיגמא	P4957
עגל עוברית סרום	בינוני מוסף	Gibco	10099-141
GFAP	נוגדן	DAKO	Z0334
B-III טובולין	נוגדן	Promega	G7121

* כדי להפוך, Hem תערובת 1 x 10 L חבילת MEM ו 160 מ"ל של 1M HEPES ולהביא נפח 8.75 ל 'באמצעות מים מזוקקים. הגדר את PH הסופי 7.4 ולאחסן אותו ב 4 ° C.