מאמר שיטה

התקני microfluidic פשוטים עבור

DOI:

10.3791/3780

⸱

30 בספטמבר 2012

 ,  , 
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה חופשיה In vivo הדמיה של ג elegans, שלם דרוזופילה זחלים וזחלי דג זברה. המכשיר מנצל PDMS קרום deformable לשתק אורגניזמים המודל הבא על מנת לבצע זמן לשגות הדמיה של תהליכים רבים כגון קצב לב, חלוקת תא והובלה עצבית משנה הסלולר. אנו מדגימים את השימוש במכשיר זה ולהראות דוגמאות לסוגים שונים של נתונים שנאספו ממערכות מודל שונות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכשירי fluidic מייקר מפוברק לספק סביבת מייקרו נגישה למחקרי vivo על אורגניזמים קטנים. תהליכי ייצור פשוטים זמינים עבור התקני microfluidic באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות 1-3. התקני microfluidic שמשו במשך הדמית משנה הסלולר 4,5, in vivo ליזר microsurgery 2,6 וסלולרית הדמיה 4,7. בחי ההדמיה דורשת קיבוע של אורגניזמים. זו הושגה באמצעות שאיבה 5,8, ערוצים מחודדים 6,7,9, ממברנות deformable 2-4,10, יניקה עם קירור נוסף 5, הרדמת גז 11, ג'לים רגיש לטמפרטורה 12, דבק cyanoacrylate 13 והרדמה כגון levamisole 14 , בן 15. הרדמה נפוצה להשפיע על הולכה סינפטית 16,17 וידועים יש השפעות מזיקות על 4 הובלה עצביות משנה הסלולר. ברחוב זהג'ודי אנחנו מדגימים קרום בסיס פולי דימתיל-siloxane מכשיר (PDMS) המאפשר קיבוע ללא הרדמה של אורגניזמים מודל גנטיים תקינים כגון elegans Caenorhabditis (סי אלגנס), זחלי דרוזופילה וזחלי דג זברה. אורגניזמים מודל אלו מתאימים למחקרי vivo במכשירי microfluidic בגלל קוטרם הקטן והגופים שקופים אופטי או שקופים. קטרי גוף לנוע בין ~ 10 מיקרומטר ל ~ 800 מיקרומטר לשלבים מוקדמים של זחל ג זחלי elegans ודג זברה ודורש התקני microfluidic בגדלים שונים כדי להשיג קיבוע מלא ל הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות. אורגניזמים אלה משותקים באמצעות לחץ המופעל על ידי גז חנקן דחוס דרך עמודת נוזל וצלם באמצעות מיקרוסקופ הפוך. בעלי חיים ששוחררו מהמלכודת לחזור לתנועה רגילה בתוך 10 דקות.

אנחנו מדגימים ארבעה יישומים של הדמית זמן לשגות בג elegansכלומר, תחבורת הדמית המיטוכונדריה בתאי עצב, תחבורת שלפוחית ​​מראש הסינפטי בתחבורת תחבורה-פגומת מוטציה, קולטן הגלוטמט וחלוקת תא neuroblast ש. נתונים שהתקבלו מסרטים כאלה מראים שקיבוע microfluidic הוא אמצעי שימושי ומדויק של רכישה בנתוני vivo של אירועים הסלולר ומשנה הסלולר בהשוואה לחיות מורדמות (האיור 1J ו3C-F 4).

מידות מכשיר שונו כדי לאפשר הדמית זמן לשגות בשלבים שונים של ג elegans, תחילה זחלי instar דרוזופילה וזחלי דג זברה. הובלה של שלפוחית ​​מסומנים synaptotagmin מתויג עם GFP (syt.eGFP) בנוירונים חושיים תערוכות תנועה מכוונת של סמני שלפוחית ​​סינפטיים לידי ביטוי בתאי עצב תחושתיים כולינרגיות בזחלי תסיסנית שלמים 1 instar. מכשיר דומה כבר נעשה שימוש כדי לבצע הדמית זמן לשגות של פעימות לב ב~ הפרית הודעת שעה 30 (hpf)דג זברת זחלים. נתונים אלו מראים כי מכשירים הפשוטים שפתחנו ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מודל ללמוד כמה תאי תופעות ביולוגיות וההתפתחותי בגוף חי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SU8 ייצור מאסטר

  1. עצב את מבני microfluidic באמצעות תוכנת Clewin ולהדפיס אותו באמצעות פלוטר ליזר 65,024 dpi עם גודל תכונת מינימום של 8 מיקרומטר בסרט המעגלים.
  2. נקה 2 X 2 פרוסות סיליקון סנטימטר סנטימטר עם תחמוצת יליד 20% KOH ל1 דקות ולשטוף במי deionized; רקיק כל אחד לשכבה ושכבת זרימת השליטה המתאימה לו.
  3. תייבש את החתיכות עם גז חנקן ומייבש על צלחת חמה ב 120 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. לאפשר לחתיכות כדי להתקרר לטמפרטורת חדר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  4. חתיכות סיליקון מקום אחד בכל פעם על צ'אק טווה ולהדליק את הוואקום. מכסה את משטחי סיליקון עם ~ 20-disilazane hexamethyl μl (HMDS) ומעיילם באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 3000 סל"ד למשך 30 שניות.
  5. כיסוי פרוסות סיליקון לחלוטין עם ~ 1.5 מ"ל של SU8-2025 (http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) וופלי מעייל באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 2000 סל"ד למשך 30 שניות. פרוטוקול ספינינג זה מייצר עובי photoresist של ~ 40 מיקרומטר כי הוא מתאים לשליטה ולשכבות זרימה לשלבים מוקדמים של זחל ג elegans.
  6. ספין ~ 1.5 מ"ל SU8-2050 באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 2000 סל"ד למשך 30 שניות כדי להשיג עובי של photoresist ~ 80 מיקרומטר כי הוא מתאים לייצור שכבת זרימה לשלבים מאוחרים של זחל ג elegans, שכבת זרימת בסיס לזחלי תסיסנית / דג זברה ושליטת השכבות המקבילות שלהם.
  7. הנח את חתיכות סיליקון על צלחת חמה עם השכבה המצופית SU8 על העליונה. לאפות רך את החלקים המצופים סיליקון ב65 ° C לדקות 1 ואחרי 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאפשר לחתיכות כדי להתקרר לטמפרטורת חדר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  8. הנח את חתיכות סיליקון רכים אפויות על הבמה עם חשיפת SU8-2025 sur המצופהעל פניו העליונות פונה מנורת UV. השתמש במסכת התמונה עם עיצוב אני (L1, 1B איור) ועיצוב השני (L2, 1B איור) לשכבת הזרימה ודפוס שכבה מלאת בהתאמה לשלבים מוקדמים של זחל ג elegans. מניח את מסיכת צילום על גבי שכבת SU8 ולהבטיח את המסכה היא שטוחה על שכבת הציפוי. פתח את התריס של מנורת UV ולחשוף את SU8 ופלים רכים אפויים למנורת UV ואט ​​200 דרך מסיכת התמונה במשך 15 שניות.
  9. השתמש במסכת התמונה עם עיצוב אני (L1, 1B איור) ועיצוב השני (L2, 1B איור) בSU8-2050 חתיכות מצופות (מוכן בשלב 1.6) לפברק את השכבה ושכבת שליטת זרימה לשלבים מאוחרים של זחל ג elegans. השתמש במסכת התמונה עם העיצוב אני (L1, התרשים 1C) ועיצוב השני (L2, התרשים 1C) לשכבת בסיס הזרימה ושליטת שכבת בהתאמה לזחלי תסיסנית / דג זברה על ופלים מצופים SU8-2050 (אני מוכןצעד n 1.6). לחשוף את SU8 משטחים באמצעות מסכת התמונה למנורת UV 200 ואט עבור 15 שניות.
  10. הנח את חתיכות סיליקון שנחשפו על פלטה עם שכבת הציפוי עליון. הודעה אופה את הפרוסות על 65 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 אחרי 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאפשר לחתיכות להתקרר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  11. לפתח את החלקים באמצעות פתרון המפתח SU8 למשך 20 דקות. יש לשטוף את החלקים בIso-Propyl אלכוהול (IPA) ולפוצץ גז חנקן באמצעות יבש.
  12. הנח את חתיכות סיליקון בתא ייבוש עם SU8 דפוס על גבי. מעייל חתיכות עם 50 μl של tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) אדי silane בייבוש ל2 שעות.

אמצעי זהירות: קח את אמצעי בטיחות לטיפול כימי בזמן טיפול KOH, ציפוי photoresist ופיתוח. ציפוי האדים silane צריך להתבצע בתוך תא ייבוש באזור מאוורר. הגן SU8 להתנגד מחשיפת יתר לאור. להשתמש במשקפי מגן עם lig UVמקור HT.

2. ייצור עובש PDMS

  1. הכן 10:01 PDMS על ידי שילוב של 50 גרמו מתוך 184 בסיס Sylgard עם 5 גרם של סוכן ריפוי בכוס פלסטיק. מערבב את התוכן באופן ידני ל~ 3 דקות. דגת התערובת בתוך תא ייבוש כדי להסיר את כל בועות אוויר שנוצרו במהלך הערבוב.
  2. יוצק תערובת PDMS עבה 5 מ"מ מעל את פרוסות סיליקון עם SU8 דפוס של עיצוב השני, לשליטת שכבה, בעדינות, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. במקרה בועות נוצרות בעת השפיכה, דגת PDMS על SU8 הדפוס בואקום נמוך כדי להסיר את כל הבועות.
  3. מניח את פרוסות סיליקון עם דפוס SU8-2025 של עיצוב אני, שכבת הזרימה, על צ'אק טווה ולהפעיל את הוואקום כדי להחזיק אותם. לכסות את הוופלים עם ~ 1 מ"ל של תערובת PDMS ומעייל הוופלים באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 1500 סל"ד למשך 30 שניות.
  4. מעייל ~ 1 מיליליטר תערובת PDMS על פרוסות סיליקון עם 80 מיקרומטר דפוס SU8-2050 של עיצובי (L1, 1B איור), עבורשכבת זרימה לשלבים מאוחרים של זחל ג elegans באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 1000 סל"ד למשך 30 שניות. מעייל שכבה עבה של תערובת PDMS על חלקי סיליקון עם דפוס SU8-2050 של זרימת שכבת עיצובי (L1, התרשים 1C) לזחלי תסיסנית / דג זברה, באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד עבור 35 שניות.
  5. חתיכות אופות PDMS מצופות סיליקון בעיצוב ואני ופלים עם עיצוב השני מקבילה לבקרת שכבה המכילות PDMS לג זחלי elegans ו / או תסיסנית / דג הזברה בתנור הסעת אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
  6. גזור את קטע PDMS ממצע סיליקון המכיל SU8 הדפוס השני לג elegans ו / או זחלי תסיסנית / דג זברה באמצעות סכין חד. נקוב חור קטן בקוטר ~ 1 מ"מ בחלקו העליון של מאגר חיבור המלכודת העיקרית בעובש PDMS באמצעות אגרופן אריס.
  7. הנח את אגרוף PDMS הבלוק (המכיל עובש העבה 40 מיקרומטר לבקרהשכבת L2) על מגש פלסטיק, עם הצד היצוק של שכבת השליטה פונה כלפי מעלה. מניח את פרוסות סיליקון המצופות PDMS מכילים SU8 עיצוב של 40 מיקרומטר עבה שעל אותו המגש, עם המשטח המצופה PDMS פונה כלפי מעלה. הכנס את המגש בתוך החדר של שואב פלזמה ולהפעיל את הוואקום עבור 2 דקות. לאחר מכן, הפעל את כוח הפלזמה ולהנמיך את לחץ החדר עד החדר הופך ורוד בהירה בצבע. לחשוף את שני המשטחים לאוויר ואט פלזמה 18 תחת ואקום נמוך עבור 2 דקות.
  8. הנח את בלוק אגרוף PDMS הוצא מ80 מיקרומטר העבה SU8 אדון מכיל דפוס II לשלבים מאוחרים של זחל ג זחלי elegans או תסיסנית / דג זברה על מגש פלסטיק, עם הצד היצוק של שכבת השליטה פונה כלפי מעלה. הנח את הספין המקביל האפוי PDMS שכבת ציפוי על פרוסות סיליקון המכילות עיצוב עבה 80 מיקרומטר למועד מאוחר יותר ג שלבי elegans או זחלי תסיסנית / דג הזברה בו זמנית על אותו המגש עם ציפוי של PDMS שטוחurface פונה כלפי מעלה. השתמש באותו הפרוטוקול שהוזכר לעיל כדי לחשוף אותם לאוויר פלזמה.
  9. הנח את שני משטחי הפלזמה שטופלו במשך ג elegans ו / או זחלי תסיסנית / דג הזברה יחד עם לחץ עדין ואופה אותם בתנור הסעת אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  10. גזור את המכשירים המלוכדים ממצע סיליקון עם SU8 עיצובי לג elegans ו / או זחלי תסיסנית / דג זברה. חורי גישת Punch במאגרי הכניסה ויציאה של ערוץ הזרימה.
  11. הנח את תבנית PDMS מלוכדות על מגש פלסטיק לג elegans, עם הצד המעוצב של עיצוב שכבת הזרימה כלפי מעלה. תלוש נקי מכסה זכוכית (22 מ"מ X 22, עובי מס '1) ומניח אותו על אותו מגש הפלסטיק. הכנס את המגש המכיל עובש PDMS ותלוש כיסוי זכוכית בתוך חדר הפלזמה. לחשוף את המשטח התחתון PDMS של המכשיר ולהחליק מכסה זכוכית פלזמה עד 18 ואט אוויר בלחץ נמוך עבור 2 דקות. הנח את שני משטחי הפלזמה שטופלו בgenלחץ TLE ואופה אותם בתנור הסעת אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  12. תאחסן את המכשיר בסביבה נקיה לשימוש עתידי.

3. צעדים נוספים למכשיר תסיסנית / דג הזברה

  1. לחשוף את משטח זכוכית נקיה בגודל 2 סנטימטר 2 סנטימטר עם 50 μl של tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) אדי silane בייבוש ל2 שעות.
  2. ספין ~ 1 מ"ל של תערובת 10:01 PDMS המוכן בשלב 2.1 על משטח זכוכית silanized באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד עבור 35 שניות. אופה את מצעי זכוכית המצופות PDMS בתנור אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות עם המשטח המצופה פונה כלפי מעלה. אפשר שכבת PDMS להתקרר לטמפרטורת חדר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  3. אגרוף המצופית השכבה באמצעות אגרופן מתכת מותאמת אישית נבנה חד באמצע PDMS, כדי ליצור שכבת spacer PDMS. הצורה של אגרופן המתכת מיועדת דומה לעיצוב הזרימה לדרוזופילה / דג זברה (L1, התרשים 1C ).
  4. לחשוף את שכבת spacer PDMS ואחת מלוכדות בלוק (שכבת זרימה ושכבת שליטה, בצעה בשלב 2.9 עבור זחלי תסיסנית / דג זברה) לאוויר ואט פלזמה 18 באמצעות שואב פלזמה בואקום נמוך. הנח את שני משטחי הפלזמה שטופלו יחד ואופה אותם בתנור חם באוויר 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  5. חותך את המכשיר המלוכד מהזכוכית, חורי גישת ניקוב במאגרי הכניסה ויציאה והאג"ח זה למעידת כיסוי זכוכית (22 מ"מ X 22, עובי מס '1), תוך שימוש בשואב פלזמה כאמורה בשלב 2.11. זה היה לייצר מכשיר קיבוע לזחלי תסיסנית instar הראשונים עם גובה של ערוץ ~ 500 מיקרומטר. לזחלי דג זברה, לשכפל את תהליך ייצור שכבת spacer PDMS עם מליטת צעד נוסף. השכבה הכפולה של PDMS-S מייצרת ערוץ גובה של 900 מיקרומטר לזחלי 30 HFP דג זברה.

אמצעי זהירות: הימנע מחלקיקי אבק בייצור מכשיר. שתי פלזמה ניקתה משטחזה צריך להיות לגמרי אבק חופשי לקשירה נאותה. אחסן את המכשירים בתא ייבוש במצבים שבי חדר נקי מיוחד אינו זמין במטרה למזער הצטברות של חלקיקי אבק במכשירים.

4. שימוש PDMS ממברנה

  1. חבר קצה אחד של שפופרת מייקרו-Flex (קוטר פנימי ~ 1.6 מ"מ, קוטר חיצוני ~ 4.8 מ"מ) לרגולטור לחץ חנקן אספקת גז ואת הקצה השני למאגר המלכודת העיקרי באמצעות מחט 18 מד (קוטר חיצוני ~ 1.25 מ"מ) דבוק לצינור. ברזלים 3-דרך השתמשו באמצע חיבור הצינור מאפשרים יישום או שחרור של לחץ בקרום.
  2. מלא את הצינור מחובר למכשיר PDMS עם עמודת 10 סנטימטרים של מים מזוקקים לפני חיבורו למאגר של המלכודת העיקרית של ג מכשיר זחלי תסיסנית / דג זברת elegans ו / או.
  3. לסגור את השסתום של אספקת החנקן לקרוא 14 psi ולפקח על הממברנה של המלכודת העיקרית להסיט לכיוון הדואר ערוץ זרימה בהגדלה נמוכה של מיקרוסקופ הפוך. אורכה של עמודת המים בצינור מייקרו-Flex נדחס כל פעם הברזלים 3-הדרך פתוח. קצוות של הקרום הסיט נראים באור מועבר (איור 1 ט ו1J). סטיית ממברנה גורמת תזוזה של חלקיקי אבק / בועות תחת קרום PDMS ודוחפת אותם לגבולות הערוץ.
  4. חכה עד לפני הנוזל ממלא microchannel לחלוטין ללא כל אוויר לכוד.
  5. לשחרר את הלחץ על ידי שימוש בברזלים 3-דרך להירגע הקרום למצב ההמנוח שלו.

5. הכנסת ג זחלי elegans, דרוזופילה ודג זברה לתוך המכשיר ולשתק אותם מתחת לממברנה PDMS הגמישה

  1. מלאו ערוץ הזרימה עם M9 חיץ [3 גרמו KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 ז MgSO 4, H 2 O ל 1 ליטר, לעקר ידי autoclaving] לג PBS elegans 18 או 1X [8 גרם NaCl, 0.2 גר 'KCl, 1.44 גרם Na 2 4 HPO, 0.24 גרם KH 2 PO 4, H 2 O ל 1 ליטר, לעקר ידי מעוקר] לזחלי תסיסנית / 19 דג זברה למשך 10 דקות לפני ניסוי.
  2. אתר יחיד ג elegans של שלב הנדרש על צלחת NGM 18 (או זחלי תסיסנית instar ראשונים מצלחת אגר ביצה או הזחלים ידניים dechorionated 30 hpf דג זברה בנוזל 20) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו הגדלה נמוכה. בחר חיה יחידה באמצעות נפח קטן של חיץ לפתרון קצה מייקרו. השתמש בקצה מייקרו עם סיומה לחתוך כדי להתאים תסיסנית הגדולה או זחלי דג זברה במאגר.
  3. דחוף את האורגניזם הבודד דרך כניסת ערוץ הזרימה. התאם את לחץ pipetting כדי למקם את חית הפרט תחת המלכודת העיקרית.
  4. להגביר את הלחץ של PDMS הקרום לאט כדי למקם את החיה נגד צ'אןגבול nel ולשתק אותו עם לחץ 14 psi לג elegans, 7 psi לדרוזופילה ו3 psi לזחלי דג זברה.
  5. מקם את החיה המשותקת במרכז השדה המיקרוסקופי של תצוגה. השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדרות רצויות עבור שדה ברזולוציה גבוהה בהיר או דימות פלואורסצנטי. לרכוש תמונות בודדות או קרינת זמן לשגות בקצב מסגרת מוגדר מראש.
  6. שחרר את לחץ המלכודת ולפקח על התנועה של בעלי החיים לדקות 5-10 בהגדלה נמוכה.
  7. יש לשטוף את החיה ולהכניס בעלי חיים טריים לחזור על השלבים לעיל.
  8. שטוף את כל החיות ממאגר הפסולת באמצעות מים מזוקקים מיושמים באמצעות מזרק. ייבש את הערוץ על ידי דחיפת אוויר באמצעות מזרק לשימוש חוזר בעתיד.

אמצעי זהירות: בעלי חיים הדורשים לחץ גבוה pipetting לזרום בתוך הערוץ העיקרי נוטה להראות תנועה / בריאות לקויה לאחר שחרורו מהמלכודת ויש להימנע לimaגינג. נקה את ערוץ זרימה לכל שמץ של חיץ כדי למנוע סתימה של ערוץ על ידי גבישים. אם שמן משמש להדמיה ברזולוציה גבוהה, לנקות את תלוש כיסוי הזכוכית כדי להיות מסוגל לשמור על אות טובה יחס רעש לניסויים באים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכשיר הקיבוע הוא בלוק bilayer PDMS המפוברק על ידי שתי שכבות מליטות: שכבת זרימה (שכבה 1) ושכבת שליטה (שכבה 2) כפי שמוצג באיור 1. המלכודת הראשית מחוברת לבלון גז חנקן באמצעות רגולטור וזין תחנה 3-דרך ליישם את הלחץ דרוש (3-14 psi) על גבי הקרום דרך עמודת נוזל (איור 1 א). הקרום הסיט immobilizes ג זחלי elegans, דרוזופילה או דג זברה בערוץ הזרימה מתוכננת עם ממדים שונים (התרשים 1B ו1C). מסכות תמונה משמשות לעצב שכבות מכשיר ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקני microfluidic PDMS הם שקופים אופטי ולכן ניתן להשתמש בו לרזולוציה גבוהה בתחום הדמית vivo של כל אורגניזם מודל שקוף / שקוף. התכנון שלנו הוא מתאים להדמית הגדלה גבוהה זמנית spatio של אירועים הסלולר ומשנה הסלולר בבעלי חיים שלמים. Microfabrication באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות מאפשר מניפולציה קלה של מידות מכשיר לגדלים שונים של אורגניזם מודל. מכשירים בגדלים שונים מיוצרים עבור שלבים שונים של ג elegans, זחלי דרוזופילה וזחלי דג זברה. התקנים עם גבהים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר Krishanu ריי למניות תסיסנית, Tarjani Agarwal לשמירת תסיסנית כלוב, פיטר Juo לnuIs25 וCGC לג זני elegans. SPK עשה jsIs609 במעבדתו של מייקל התשיעייה. אנו מודים Arpan Agnihotri (Pilani BITS) על עזרתו בזמן לשגות הדמיה של תחבורת מיטוכונדריה של jsIs609 בעלי חיים בהתקני microfluidic. אנו מודים לד"ר Vatsala Thirumalai וסורייה פראקאש שספק לנו עוברי דג זברה. אנו מודים לד"ר קרישנה וCIFF בבנק המרכזי לאומי לשימוש במיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב נתמך על ידי משרד מדע וטכנולוגיה, המרכז לננוטכנולוגיה (מס SR/55/NM-36-2005). אנו מודים גם לKaustubh ראה, ו 'Venkatraman וChetana Sachidanand לדיונים. עבודה זו מומנה על ידי מלגת DBT פוסט הדוקטורט (SM), ערכת מסלול מהיר DST (SM) וDBT מענק ל( SPK). SA נתמך על ידי מענקי DST וCSIR לSPK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
פרוסות סיליקון רקיק אוניברסיטה 150 מ"מ (100) Mech כיתת SSP סי
Clewin תוכנה WieWeb תוכנה גרסה 2.90
פלוטר ליזר הדמית קו דקה 65024 DPI
HMDS סיגמה אולדריץ 440191-100 מ"ל
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
מפתחים Microchem SU8 מפתחים
Silane סיגמה אולדריץ 448931-10G
PDMS Dow Corning Sylgard 184
מנורת UV אוריאל 66943 200W הכספי אוריאל אור
תנור אוויר חם מכשירי Ultra Custom made הגדר ב 50 מעלות צלזיוס
פלטה ציוד מעבדת איקא 3810000 http://www.ika.com
שואב פלזמה Harrick פלזמה PDC-32G
טווה מערכות ייצור מוליכים למחצה SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
תלוש כיסוי זכוכית זהב חותם 22 22 מ"מ X, עובי מס '1
סי אלגנס Caenorhabditis גנטיקת המרכז (CGC) e1265, ayIs4
דרוזופילה בלומינגטון P {chaGAL4} / ארגון נוער קתולי, כטב"מ-syt.eGFP
דג זברה סוג פראי הודי סוג פרוע
צינור Tygon סיגמא Z279803
מחט מייקרו סיגמא Z118044 חותך לחתיכות 1 סנטימטר
3-way ברזלים סיגמא S7521
אגרופן אריס סיגמא Z708631
גז חנקן דחוס ספק גז מקומי השתמש בוסת, כדי לשלוט בלחץ
מיקרוסקופ סטריאו ניקון SMZ645
מיקרוסקופ confocal תידור ואולימפוס Yokogawa ספינינג דיסק confocal מיקרוסקופ
ImageJ המכונים הלאומיים לבריאות www.rsbweb.nih.gov / ij Java תכנית עיבוד תמונה מבוססת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200(2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMSTime Lapse Imaging

מאמרים קשורים