ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה"כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

Summary

השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.

Abstract

מיקרוסקופיה TIRF התפתחה טכנולוגיית ההדמיה עוצמה ללמוד במרחב ובזמן בדינמיקה של מולקולות ניאון במבחנה בתאים חיים ^1. תופעה אופטית של השתקפות פנימית מוחלטת מתרחשת כאשר האור עובר מתווך בעל מקדם שבירה גבוה לתוך בינוני עם מקדם שבירה נמוך בזווית גדולה יותר מזווית ביקורתית אופייני (כלומר קרוב יותר להיות במקביל הגבול). למרות כל האור משתקף בחזרה בתנאים כאלה, גל חולף נוצר כי תנועתו ברחבי ולאורך הגבול, אשר דועך אקספוננציאלית עם המרחק, ורק חודר אזורים מדגם כי הם 100-200 ננומטר ליד ממשק ^2. בנוסף למתן החלטה צירית מעולה, עירור מופחת מתוך fluorophores מיקוד יוצר אות גבוהה מאוד יחסי רעש ממזער ההשפעות המזיקות של photobleaching ^2,3. להיות טכניקה widefield, TIRF גם מאפשר תמונה AC מהר יותרquisition יותר מרוב סריקה setups confocal מבוססות.

במבט ראשון, את עומק החדירה הנמוכה של TIRF נראה עולה בקנה אחד עם הדמיה של תאים חיידקיים פטרייתי, אשר מוקף בדרך כלל על ידי קירות התא עבה. נהפוך הוא, מצאנו כי דופן התא של שמרים תאים חיידקיים למעשה לשפר את השימושיות של TIRF ולהגדיל את טווח מבנים נצפים ^4-8. תהליכים תאיים רבים ולכן ניתן לגשת ישירות קטנים, תאיים, אשר לעיתים קרובות מציעים עוצמה טכניקות מניפולציה גנטית של TIRF. זה מאפשר לנו לבצע ניסויים ביוכימיה vivo, שבו קינטיקה של אינטראקציות חלבון ופעילות ניתן להעריך באופן ישיר בתאים חיים.

נתאר כאן את הצעדים הנדרשים כדי להשיג בודדים TIRF תמונות באיכות גבוהה עבור cerevisiae Saccharomyces או תאים subtilis Bacillus. אנו להצביע על בעיות שונות שיכולות affeCT TIRF ויזואליזציה של בדיקות ניאון בתאים וכן להמחיש את הליך עם דוגמאות של יישומים שונים. לבסוף, אנו מראים כיצד תמונות TIRF ניתן לשפר עוד יותר באמצעות טכניקות מבוססות שיקום התמונה.

Protocol

1. לדוגמא הכנת

1. הכנת תלושי כיסוי
   Coverslips יש לנקות בין חלקיקי האבק כמו TIRF רגיש אותות רקע הנובעים coverslip (איור 1 א ', סרט 1).
   1. באמצעות מלקחיים כיסוי תלושי מקום בעריסה חרס עם מכסה.
   2. מילוי מיכל זכוכית עם 1 M NaOH (ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים).
   3. דגירה של H 2 תחת סיבוב איטי מתמשך (מסלולית שייקר). הדגירה מופרזת (> ....

Discussion

מיקרוסקופיה TIRF היא הטכניקה של בחירה לחלבונים תמונה הפריפריה. עומק החדירה הנמוך של תחום חלוף ממזער את האור של המוקד, אשר מוביל אות טובה מאוד יחס רעש ומאפשר רכישת נתונים עם מסגרת חליפין גבוה, או הדמיה של חלבונים ביטוי מאוד חלש. שילוב של ניגודיות גבוהה מסגרת חליפין גבוה עושה מיקרוסקופיה TIRF הכלי המושלם ביותר עבור הדמיה במרחב ובזמן הדינמיקה של חלבונים מקומיים cortically. מעניין לציין את דופן התא עבה סביב מיקרואורגניזמים רבים לא לעכב הדמיה של חלבונים הפריפריה על ידי TIRF. למעשה, הדו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם הכלי / מגיב	סוג	חברה	מספר קטלוגי
Orbital שאכר	כלי	UniEquip	UNITWIST 3-D Rocker שאכר
TIRF מיקרוסקופ	עד		התקנה מותאמת אישית
מיכל זכוכית	כלי	Vitlab	340-232880353
צביעת קרמיקה המדף	כלי	תומאס מדע.	8542E40
Concanavalin	מגיב	סיגמא	L7647
Coverslips # 1 (18 x 18 מ"מ)	מיקרוסקופ	מנצל גלזר	BB018018A1
מיקרוסקופ שקופיות	מיקרוסקופ	מנצל Gלייזר	AA00000102E
טבילה שמן	מיקרוסקופ	Zeiss	Immersol 518F
Agarose	מגיב	Invitrogen	16500-500
FluoSpheres	מגיב	Invitrogen	F8795