המחקר מתאר את התפתחות במבחנה Electroporation טכניקה המאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים שפתיים rhombic התחתון של עוברי midgestation.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation
במאמר זה
סיכום
תקציר
השפה היא rhombic neuroepithelium עובריים למוח האחורי ממוקם בצומת שבין הצינור העצבי ואת roofplate של החדר הרביעי (בדיקה ב 1). השפה rhombic נחלקים השפה rhombic העליון (URL) הכולל rhombomere 1 (R1), ויוצר הנוירונים של המוח הקטן ואת השפתיים rhombic נמוך (LRL), אשר מעלה את מגוון שושלות גזע המוח נוירונים 2-4. נגזרים LRL כוללים הנוירונים קולי של גרעינים שבלול ושל גרעינים precerebellar המעורבים בוויסות איזון ושליטה מוטורית 5-8. Neurogenesis מ LRL מתרחשת מעל חלון הזמני גדול שמקיף ימים עובריים (ה) 9.5-16.5 5, 9. שושלות עצביים שונים לצאת מן LRL כמו תאים postmitotic (או נולדו) במהלך ימים התפתחותיים שונים במהלך חלון זה neurogenic.
Electroporation של מבנים ביטוי גנים יכולה לשמשלתפעל ביטוי גנים אבות LRL ואף עלולים לשנות את גורלם של נוירונים המופקים באזור זה 10-12. ביטוי גנים שינוי של אבות LRL של העכבר באמצעות ב electroporation ברחם היה מוצלח מאוד עבור מניפולציה שושלות שנולדו ביום עובריים E12.5 או במאוחר 10, 12-14. ב electroporations ברחם לפני E12.5 לא הצליחו בעיקר בשל הקטלניות קשור ניקוב roofplate החדר הרביעי, צעד הכרחי באספקת DNA אקסוגני אשר electroporated אל LRL. עם זאת, רבים שושלות הנגזרות LRL נובעים LRL לפני E12.5 9. שושלות אלו שנולדו לפני כן כוללים הנוירונים המרכיבים את הרשתית לרוחב, דמויי יתד? חיצוני, גרעינים olivary הנחות של מערכת precerebellar שבה לתפקד להתחבר כניסות מ חוט השדרה אל קליפת המוח הקטן 5. על מנת לתפעל ביטוי LRLעוברים מתחת לגיל E12.5, פיתחנו במערכת במבחנה שבה עוברים ממוקמים בתרבות בעקבות electroporation.
מחקר זה מציג שיטה יעילה ואפקטיבית על מניפולציה של ביטוי גנים של אבות LRL ב E11.5. עוברים electroporated עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מונע מן האמרגן החטיבה פעילה רחב reproducibly הביע GFP לאחר 24 שעות של תרבות. היבט חשוב של assay זה הוא ביטוי גנים משתנה רק בגלל הביטוי של הגן אקסוגני ולא בגלל השפעות משניות הנובעות electroporation וטכניקות culturing. נקבע כי ביטוי את דפוסי גנים אנדוגניים להישאר ללא הפרעה עוברים electroporated ותרבותיים. Assay זה יכול להיות מנוצל כדי לשנות את גורלו של תאים המתפתחים מתוך LRL של עוברים מתחת לגיל E12.5 באמצעות הקדמה של פלסמידים עבור ביטוי יתר או להפיל (באמצעות RNAi) של אחר בעדגורמי שעתוק עצביים.
פרוטוקול
1. ההכנות שקדמו electroporation
- להגביר את ה-DNA על ידי electroporation הכנה מקסי (בפריים זה או Qiagen). הריכוז של ה-DNA צריך להיות מינימום של 1 מ"ג / מ"ל לספיגה יעילה.
- הסרה של 495 μL של ה-DNA ומערבבים עם μl 5 של גרין מהיר 0.01% ב 1 X PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) בצינור microcentrifuge.
2. העוברית קציר
- להקים הזדווגויות זמן קבועי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בטכניקה electroporation במבחנה הציג במחקר זה היא מתודולוגיה חדשנית יכול להיות מנוצל ביעילות לתמרן ביטוי גנים העוברים מתחת לגיל 12 ימים של הריון. המיקום של העוברים לתוך תרבות מאפשרת ביטוי של גן הציג עוקף הקטלניות נצפתה כאשר עוברים electroporated מותר להישאר in vivo. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים עובריים אבות שהיו נגישים בעבר עבור electroporation מבוססי מחקרים.
הטכניקה electrop.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
המחברים מבקשים להודות ג'יין ג'ונסון עבור Math1, Ngn1, ואת נוגדנים Ptf1a וקוני Cepko עבור pCAG :: GFP פלסמיד. עבודה זו מומנה על ידי NIH 1R15HD059922 R15-01.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (לא חובה) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie עצה Dumoxel טיפול דומונט מלקחיים | כלים מדעיים יפות | 11252-30 | |
| 20 מ"מ מוריה כף מחוררת | כלים מדעיים יפות | 10370-17 | |
| ECM 830 electroporation כיכר Wave Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| הרווארד Apparatus Tweezertrodes 7 מ"מ * אלקטרודות | BTX (פישר) | BTX450165 | |
| פישר Isotemp CO 2 החממה | דיג | 1325525 | |
| NAPCO CO 2 גז הרגולטור | דיג | 15497020 | |
| 12 ובכן בתרבית רקמה צלחות | BD פלקון (פישר) | 877229 | |
| HyClone נוזלי מדיה DMEM/F-12 (1:1), עם גלוטמין-L ו HEPES: 500 מ"ל | Thermo Scientific (פישר) | SH3002301 | |
| HyClone * תורמים סוסים סרום | Thermo Scientific (פישר) | SH3007402 | |
| העובר שור סרום, מוסמך, מומת חום | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro * 10,000 IU פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין | Mediatech (פישר) | MT-30-002-CI | |
| HyClone * L-גלוטמין L-גלוטמין: 200mM ב NaCl 0.85% | Thermo Scientific (פישר) | SH3003401 | |
| מהיר גרין | דיג | AC41053-0250 | 0.01% |
מקורות
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cere....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
