מאמר שיטה

Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

12.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3999

⸱

16 במאי 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

במאמר זה

סיכום

שיטת ספירת CD4, α-הבדיקה, מתואר אשר עושה שימוש הרוק כולו לספק מהיר ומדויק ספירת CD4. את α-הבדיקה עולה פרוטות ומונע את הצורך טכניים, חומרים כימיים אימונים יקרים כגון נוגדנים חד שבטיים, מכשור, קירור, הובלה של דגימות, וכן איסוף וטיפול של דם.

תקציר

קיים צורך דחוף בשיטה זולה לספירת תאי CD4 לצורך מעקב אחר מחלת ה-HIV. ספירת תאי CD4 אינה נגישה באזורים עם משאבים מוגבלים בשל מגבלות זמן וטמפרטורה, הדרישות למיומנות טכנית גבוהה ועלות הרכיבים, ובמיוחד הנוגדנים המונוקלונליים המשמשים למדידת CD4 על תאי דם, שהיא השיטה המקובלת היחידה כיום. אסטרטגיה מעבדתית נפוצה לחיסכון בעלויות ובזמן היא חישוב של ערכי דם מסוימים במקום מדידתם. לדוגמה, רמות LDL מחושבות באמצעות הרמות הנמדדות של כולסטרול כולל, HDL וטריגליצרידים1. לפיכך, זיהוי של מדדים ללא תאים המסדירים באופן ישיר את מספר תאי ה-T מסוג CD4+ עשוי לספק שיטה מדויקת לחישוב ספירת תאי CD4, וזאת בשל הרלוונטיות הפיזיולוגית של מדדים אלו.

מספר תאי הגזע שנכנסים לדם ונועדו להפוך לתאי T מסוג CD4+ במחזור הדם נקבע על ידי הכמוקין CXCL12 והרספטור שלו CXCR4, בשל השפעתם על תנועת התאים (locomotion)2. תהליך תנועת תאי הגזע אל הדם מוסדר בנוסף על ידי האנזים elastase של לוקוציטים אנושיים על פני השטח של התא (HLECS) והמעכב הפעיל α1proteinase inhibitor המגיב ל-HLECS (α1PI, α1antitrypsin, SerpinA1)3. במחלה הנגרמת על ידי HIV-1, ה-α1PI מנוטרל עקב תהליכי המחלה 4. בקטגוריות האסימפטומטיות המוקדמות של מחלת HIV-1, נמצא כי רמת ה-α1PI הפעיל הייתה נמוכה מהנורמה ב-100% מהחולים עם HIV-1 שאינם מטופלים (חציונ=12 μM), וכי היא מגיעה לרמות נורמליות במהלך הקטגוריות הסימפטומטיות4, 5. דפוס זה ייחסה לאינאקטיבציה חיסונית, ולא לסינתזה לא מספיקה, אינאקטיבציה פרוטאולית או חמצון. הבחנו כי בנבדקים עם HIV-1 בעלי >220 CD4 cells/μl, ספירת תאי ה-CD4 הייתה במתאם עם רמות ה-α1PI הפעיל בסרום (r2=0.93, p<0.0001, n=26) ועם α1PI לא פעיל (r2=0.91, p<0.0001, n=26) 5. מתן α1PI לנבדקים נגועים ב-HIV-1 ולנבדקים שאינם נגועים הוביל לעליות דרמטיות בספירת תאי ה-CD4, מה שמעיד על כך ש-α1PI משתתף בוויסות מספר תאי ה-CD4+ T בדם 3.

בעזרת גרייה, רוק מלא מכיל מספיק נזילה סרוזית (פלסמה המכילה חומר חלבוני העוברת דרך דפנות כלי הדם אל הרוק) כדי לאפשר מדידה של α1PI פעיל, והמתאם של מדידה זו מהווה ראיה לכך שזוהי שיטה מדויקת לחישוב ספירות CD4. בקצרה, סיאלוגוגים (מעוררי הפרשת רוק), כגון מסטיק או חומצת לימון, מעוררים נזילה של סרום אל תוך רוק של הפה כולו. לאחר עידוד נזילת הסרום, נמדדת הפעילות של α1PI מהסרום ברוק על ידי יכולתו לעכב את פעילות האלסטאז. אלסטאז לבלב של חזיר (PPE) הוא מקור זמין וזול לאלסטאז. PPE נקשר ל-α1PI ויוצר קומפלקס ביחס של אחד לאחד המונע מה-PPE לבקע את הסובסטראטים הספציפיים שלו, שאחד מהם הוא הפפטיד הצבעוני, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). דגירה של רוק עם ריכוז רווי של PPE למשך 10 min בטמפרטורת החדר מאפשרת את קישור ה-PPE לכל ה-α1PI הפעיל ברוק. העיכוב שנוצר של PPE על ידי α1PI פעיל ניתן למדידה על ידי הוספת הסובסטראט SA3NA של ה-PPE. (Figure 1). למרות שספירות CD4 נמדדות במונחים של נפח דם (CD4 cells/μl), ריכוז ה-α1PI ברוק קשור לריכוז הסרום ברוק, ולא לנפח הרוק, מכיוון שהנפח עשוי להשתנות במידה ניכרת במהלך היום ומאדם לאדם6. עם זאת, כמעט כל החלבון ברוק נובע מתכולת הסרום, ותכולת החלבון של הרוק ניתנת למדידה7. לפיכך, α1PI פעיל ברוק מחושב כיחס לתכולת חלבון הרוק ומכונה מדד α1PI. התוצאות המוצגות כאן מדגימות כי מדד α1PI מספק שיטה פיזיולוגית מדויקת וקוהרנטית לחישוב ספירות CD4.

פרוטוקול

1. להכין פתרונות עבודה טריים

  1. כפות: 0.05 מ 'טריס בופר pH מלוחים, 7.8 (TBS). הכן 60 מ"ל כפות / microplate.
  2. PPE: elastase חזירי הלבלב, סוג 1 (PPE) הוא כאמור ההשעיה. לנער היטב לדלל PPE ב TBS בכ 0.01 U / ml. הכן 6 מ"ל עובדים פתרון / microplate).
  3. SA 3 NA: Succinyl-L-ALA-L-L-ALA-ALA-P-nitroanilide (SA 3 NA). להכין 0.1 מ 'מניות SA 3 פתרון NA ב sulfoxide דימתיל (DMSO) ולהשתמש באופן מיידי או לשמור ב -20 ° C. הכן את הפתרון עובד microplate 6ml / ידי דילול המניות SA 3 פתרון NA 1/100 ב TBS.
  4. COOMASSIE כחול: הכן פתרון מלאי של 10% Coomassie בריליאנט בלו R-250 (Coomassie כחול) ב TBS ולהשתמש באופן מיידי או בחנות ב -20 ° C. הכן 6 הפתרון עובד מ"ל ידי דילול המניות פתרון 1/1000 ב TBS.

2. הכן את הרוק

  • אוסף רוק: במצב עמידה, לעורר דיות סרום לתוך הרוק על ידי הנחת sialogogue כגון חומצת לימון או מסטיק בפה. ירידה ללא סוכר לימון נוח HIV-1 מטופלים שאינם edentulous לעתים קרובות מסוגלים ללעוס מסטיק. לבלוע לפי הצורך דקות 3 1, ולאסוף רוק בפה כל לכוס כתרים דקות 3 הבא. זה יספק כ 2 מ"ל של רוק. להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C.
  • טיפול בתוצרת הרוק: אם הדגימה קפוא, הפשרה על 37 מעלות צלזיוס ומניחים על קרח. אחסן הדגימה טרי או מופשר ב 2-4 מעלות צלזיוס ולא יותר מ -3 ימים. האם הרוק לא מערבולת ולהימנע pipetting mucin אשר אינו מכיל exudate בסרום. אמצעי זהירות רגילים להשתמש במהלך הטיפול בו רוק http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

    • 3. Microplate Set-up

    1. חוצץ: המדידות מבוצעות בשלושה עותקים. כדי גם כל אחד צלחת microtiter נוסף 130 כפות μL.
    2. דוגמאות: במבחן זה היטב, מוסיפים 20 רוק μL עבור נפח סופי של μl 150 / היטב. מערבבים ידי pipetting ללא החדרת בועות.
    3. CONTROLS: שליטה חיובית מכיל PPE, אבל לא רוק. הביקורת השלילית מכיל רוק, אבל לא PPE.To הביקורת החיובית גם הוא הוסיף 20 כפות μL. שליטה שלילי גם הוא הוסיף 20 רוק μL.
    4. דגירה PPE: נער פתרון PPE עובד היטב. הוסף 50 μL פתרון PPE עבודה זה גם לא כולל את בארות שליטה שליליות. כדי בארות שליטה שליליות, מוסיפים 50 כפות μL. דגירה 10 דק 'ב 23 ° C.
    5. דגירה תשתית: הוסף 50 μL SA 3 פתרון NA פועלים היטב כל אחד מהם. דגירה 45 דק 'ב 23 ° C.
    6. COOMASSIE כחול:. הוסף 50 הפתרון μL Coomassie כחול עובד < / Li>
    7. לקריאה מתוך: קרא ספיגת ב microplate הקורא, 405 ננומטר לזהות SA 3 המחשוף NA המייצג פעיל α 1 PI ו 595 ננומטר לזהות Coomassie כחול המייצג את תכולת החלבון.

    4. חישוב α 1 אינדקס PI

    1. לנרמל את בממוצע 405 ננומטר ננומטר 595: עבור כל אחד בשלושה עותקים, לחשב את הממוצע. הפחת הממוצע בקרה שלילית מממוצע הדגימה. כדי למזער את הצלחת אל הצלחת השינוי, לנרמל את הממוצעים על ידי חלוקת כל הממוצע הדגימה בממוצע הביקורת חיובית באופן הבא:

    figure-protocol-1

    1. חישוב 1 α לצרכן INEX: מחלקים את מספר מנורמל 405 ננומטר על ידי כמה לנורמליזציה 595 ננומטר:

    "Jove_content"> figure-protocol-2

    5. נציג תוצאות

    כדי לקבוע אם α בדיקה יכול להיות מתאים לשימוש כמבחן נקודה של טיפול הקרנה לעקוב אחר ספירת מסוג CD4 ב אנדמיים, משאבים מוגבלים לאזורים, רוק מגורה נאסף נקבה 20 ו 11 גברים HIV-1 נושאים המרפאה השתתפות עבור שגרת טיפול בקמרון. עולה בקנה אחד עם תצפיות ראשוניות במהלך הפיתוח של הבדיקה-α באמצעות רוק שנאספו בעיר ניו יורק, 1 α אינדקס לצרכן ברוק אסף בקמרון מתואם עם ספירת CD4 (r 2 = 0.91, p <0.0001. N = 31). יחסים הוגדר על ידי עקומת 3-פרמטר sigmoidal אשר עולה בקנה אחד עם יחסים מנה תגובה (איור 2 א). ביטחון 95% ו מרווחי חיזוי מתוארים בקווים כחולים ואדומים, בהתאמה (איור 2 ב).

    בתוךמחקר קודם, קבענו כי CD4 + ותאי T התערוכה אופניים סינוסי עם מחזוריות 23 ± 3.5 ימים ב-HIV-1 נושאים ו בנבדקים עם הגרסה בירושה של α 1 PI חסר (משתין) 3. במסמך זה מתוארת היא דוגמה מייצגת של המחשב שנוצר על ניתוח עקומת הסינוס של CD4 רכיבה על השליטה הלא HIV-1 בריאה מציג 27 מחזוריות היום (איור 3 א).

    מחשב שנוצר עקומת הסינוס ניתוח מסוג CD4 + את השינויים תא ה-T ב 6 נושאים הניב ערכי המשרעת שיא אל שיא ציר תנודה 3. כפי שניתן היה לצפות, ציר של תנודה היתה בקורלציה עם משרעת (r 2 = 0.96, p = 0.009, n = 6) (איור 3 ב). בחולים יהיה CD4 + T נמוך ספירת תאים, שינויים מחזוריים ספירת תא T מסוג CD4 היו קטנים, ובחולים עם CD4 גבוהות + ספירות טי סלולריים, שינויים מחזוריים גדולים.

    כיקו רגרסיה מתואר באיור 2 מעריכה את ציר התנודה ואת ציר תנודה מתואם עם אמפליטודה, משרעת ניתן לחשב את קו הרגרסיה ובכך להעריך כמה רחוק מעל ומתחת קו רגרסיה מסוג CD4 + ותאי T צפויה להשתנות בהתאם רכיבה על אופניים (איור 3 ג). שכיסה משרעת מחושב איור 3 ג ו רווח סמך חישוב 2B איור, נמצא כי משרעת (הקו הירוק) נמצא במרחק 95% רווח בר סמך (הקו הכחול) (איור 3D).

    figure-protocol-3
    באיור 1. סיכום הליך: חומצה ציטרית מקום בפה לאסוף רוק. הוסף הרוק בדילול מלא לבארות של microplate בשלושה עותקים. הוסף PPE זה טוב דגירה של 15 דקות בשעה 23 ° C. מוסיפים את המצע PPE זה טוב דגירה של 45 דק 'ב 23 ° C. הוסף Coomassie כחול ולקרוא על 405 ננומטר לאתר פעילות PPE ובו 595 ננומטר לזהות חלבון.

    figure-protocol-4
    איור 2. השוואה בין מבחן α עם שיטת ספירת CD4 רגיל. א) α-הבדיקה בוצעה על ידי quantitating אינדקס 1 α לצרכן ברוק מגורה כל הפה. ספירת CD4 בוצעו על ידי מעבדה רפואית עצמאית באמצעות cytometry זרימה רגילה. דם cytometry זרימת ורוק נאספו בכל ביקור במרפאה אחת. הקשר בין מדד 1 PI α ואת ספירת CD4 הוגדר על ידי עקומת 3-פרמטר sigmoidal (r 2 = 0.91, p <0.0001, N = 31). ב) 95% ו מרווחי חיזוי מתוארים כחול ואדום השורות, בהתאמה.

    figure-protocol-5
    איור 3. הדיוק של חישוב CD4 גounts באמצעות Index.A α1PI) מסוג CD4 + T תאים הציג אופניים סינוסי עם מחזוריות 27 יום בשליטה ללא HIV-1 בריא. ציר של תנודה מתואר (קו מקווקו אדום). ב ') באופן מחשב גל סינוס ניתוח של רכיבה על אופניים T מסוג CD4 התא ששימש לחישוב את המשרעת שיא אל שיא ציר התנודה ב -4 HIV-1, 1 נושאים שאינם ב-HIV -1 נושא משתין, ואת אי - HIV-1 הביקורת הבריאה המתואר חלק א 'הקשר בין CD4 + T משרעת התא ציר תנודה הוגדר על ידי עקומת 3-פרמטר sigmoidal (r 2 = 0.96, p = 0.009, n = 6). ג) הקשר בין sigmoidal משרעת ציר תנודה נגזר בין השאר ב ') נעשה שימוש כדי לחשב את האמפליטודה הצפויה (קווים ירוקים) של נקודות לאורך קו הרגרסיה (קו שחור) מ באיור 2. D) משרעת הצפוי מרווח (קווים ירוקים) היה שונה באופן משמעותי מרווח ביטחון של 95% (קווים כחולים) כפי שנקבע על ידי מבחן ויטני דרגה סכום מאן (על בסיס השוואה של ההפרש הממוצע בין מרווח ביטחון של 95% קו רגרסיה (63 תאים / μl) ואת ההבדל הממוצע בין קו משרעת קו רגרסיה (37 תאים / μl), p = 0.001).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    הסרום מכיל חי חציון 36 מיקרומטר α 1 PI ו 3.6 מיקרומטר α 2 macroglobulin (α 2 מ ') 10 הפרש של פי 8. שני חלבונים להתחרות על קשירה PPE. שני מאפיינים אלה, הריכוז PPE זיקה, נוצלו לפתח שיטה כי הוא מסוגל במיוחד למדידת α 1 PI בסרום נורמלי בנוכחות מתחרים α 2 מ '8. שיטה זו יכולה לזהות קטנה כמו 50 μ nM 1 PI בנסיוב 0.3%. בדילול בסרום של 2.5%, מחייב של 2 מ 'α כדי PPE הופך בלתי ניתן לג...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    אין ניגוד עניינים הצהיר.

    תודות

    המחקר נתמך על ידי קרן המחקר הארי וינסטון.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    שם מגיב חברה מספר קטלוגי
    , Sialogogue חומצה ציטרית 0.05M סוכריות Sugarfree של ה-EDA, 4900 אחורי N.20th סטריט, פילדלפיה, פנסילבניה 19144 ללא סוכר לימון טיפות
    חזירי elastase הלבלב, סוג 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי 63103 E1250
    Succinyl-L-ALA-L-L-ALA-ALA-P-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie בריליאנט בלו R-250 Sigma-Aldrich B7920
    רקמת התרבות שטופלו, 96 microplates גם בקטון דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader עם מסננים עבור 405 ננומטר ו -595 ננומטר MTX מעבדה מערכות, 8456 טייקו כביש, בויlding D, וינה, וירג'יניה 22182 Dynex P97277

    מקורות

    1. Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
    2. Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
    3. Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
    4. Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
    5. Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
    6. de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
    7. Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
    8. Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
    9. Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
    10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
    11. LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
    12. Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
    13. WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    Alpha One PISA3NAKumasi BlueHIV

    מאמרים קשורים