שיטה לטעון אזור תאי subventricular (SVZ) עם צבעי סיד חיווי לפעילות הסידן הקלטה מתוארת. SVZ לאחר הלידה מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים וneuroblasts. במקום להשתמש בטעינת אמבטיה אנו מזריקים צבע בלחץ בתוך הרקמה המאפשרת דיפוזיה צבע טובה יותר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
אזור subventricular (SVZ) הוא אחד משני האזורים במוח neurogenic לאחר הלידה. SVZ מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים עם תכונות astrocytic (הנקרא האסטרוציטים SVZ), neuroblasts, ותאי ביניים. Neuroblasts נולד בSVZ משיק לנדוד מרחק רב כדי נורת חוש הריח, שבו הם להתמיין interneurons. איתות אינטר באמצעות מולקולות דבקות ואותות diffusible ממלאת תפקידים חשובים בneurogenesis שליטה. רבים מאותות אלו לגרום לפעילות הסידן אינטר שמעבירה מידע בתוך ובין תאים. סידן היא פעילות ובכך משקף את הפעילות של אותות תאיים והיא דרך אופטימלית להבין איתות אינטר פונקציונלית בין תאי SVZ.
פעילות סידן נחקרה באזורים רבים אחרים וסוגי תאים, כוללים תאי גליה ונוירונים בוגרים. עם זאת, השיטה המסורתית לואהתאי D עם סיד מחוון צבע (טעינת אמבטיה כלומר) לא היו יעילים בטעינה כל סוגי תאי SVZ. ואכן, בצפיפות הסלולרית SVZ מונעת התפשטות צבע בתוך הרקמה. בנוסף, הכנת פרוסות sagittal יהיה טוב יותר לשמור על ההסדר תלת הממדי של תאים, במיוחד SVZ זרם הגירת neuroblast על הציר מקורי-הזנב.
כאן, אנו מתארים שיטות להכנת סעיפי sagittal המכילים SVZ, הטעינה של תאי SVZ עם צבע מחוון סידן, ורכישת פעילות סידן עם סרטי זמן לשגות. אנחנו השתמשנו Fluo-04:00 לצבוע לטעינת האסטרוציטים SVZ באמצעות יישום לחץ בתוך הרקמה. פעילות סידן נרשמה באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה המאפשר רזולוציה מדויקת לתאים בודדים מזהים. הגישה שלנו היא ישימה לאזורים אחרים, כולל neurogenic האזור המבוגר היפוקמפוס subgranular ואזורי neurogenic עובריים. בנוסף, סוגים אחרים של צבעים יכוליםלהיות מיושם בשיטה שתוארה.
פרוטוקול
1. הכנה של פתרונות, נתיחה, וvibratome
- פתרונות צריכים להיות מוכנים באוסמולריות והחומציות הנכונות (טבלה 1). בהשוואה לנוזל השדרתי מלאכותי (ACSF), פתרון נתיחה הוא מוכן עם ריכוזים נמוכים של נתרן וסידן, וריכוזים גבוהים של מגנזיום. זה כדי למזער תופעות excitotoxicity במהלך חיתוך.
- שני פתרוני הנתיחה וACSF חייבים להיות רוויים עם 95% O 2/5% CO 2 על ידי מבעבע במשך לפחות 10 דקות כדי להגיע לרמת החומציות הרצויה של 7.3.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמית סיד של תאי SVZ נעשתה שימוש כדי ללמוד את הדפוסים בפעילות ספונטנית בneuroblasts 10, ערוץ ביטוי הקולטן בשני neuroblasts והאסטרוציטים 4,6,8 וגלי סיד astrocytic 3. מאחר ותאים בSVZ הם או לא בוגרים או בעלי תכונות גליה, הם לא יירו פוטנציאלי פעולה 11,12, כלומר שינויים באלפית שני פוטנציאל מתח המעידים על פעילות ברשתות בוגרות אינם ישימים באזור זה. לכן, הלוכד את הסידן אירועים האיטיים יותר (על סדר שניות) היא לא רק מבחינה ביולוגית משמעותי, אבל או.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (DC007681, א.ב.), CT תאי גזע המענק (א.ב.), פארדי היסוד (א.ב.), Predoctoral רות ל Kirschstein שירות מחקר של הפרסים הלאומיים (NRSA) (SZY), ובוגר NSF מחקר מלגה (BL). אנו מודים לחברי מעבדת Bordey על הערות מועילות על כתב היד. החומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת בחלקו על ידי מדינת קונטיקט במסגרת התכנית לקונטיקט לתאי הגזע למחקר המענקים. התוכן שלה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצג בהכרח את עמדתה הרשמית של מדינת קונטיקט, המחלקה לבריאות ציבור של מדינת קונטיקט או CT חידושים, Incorporated.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מומס | חברה | מספר קטלוגים | דיסקציה (מ"מ) |
| סוכרוז | סיגמא | S0389 | נתיחה: 147 מ"מ ACSF: 0 מ"מ |
| NaCl | סיגמא | S9888 | נתיחה: 42 מ"מ ACSF: 126 מ"מ |
| KCl | סיגמא | P3911 | נתיחה: 2.5 מ"מ ACSF: 2.5 מ"מ |
| MgCl 2 0.6 H 2 O | סיגמא | M9272 | נתיחה: 4.33 מ"מ ACSF: 1 mM |
| Nah 2 PO 4. H 2 O | סיגמא | S8282 | נתיחה: 1.25 מ"מ ACSF: 1.25 מ"מ |
| גלוקוז | סיגמא | G8270 | Dissection: 10 מ"מימ ACSF: 10 מ"מימ |
| 3 NaHCO | סיגמא | S6014 | נתיחה: 26 מ"מ ACSF: 26 מ"מ |
| CaCl 2 0.2 H 2 O | סיגמא | C3306 | נתיחה: 1.33 מ"מ ACSF: 2 מ"מ |
טבלה 1. רשימה כימית ומתכונים של פתרון נתיחה וACSF.
| [כותרת] | |||
| שם | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| Vibratome | ליקה | VT 1000s | |
| Super Glue | Surehold או 3M | Surehold 3G Super Glue או 3M וטרינר בונד | |
| כלי נתיחה | Roboz או טד פלה | ||
| Fluo-04:00 לצבוע בסידן רגיש | Invitrogen | F14201 | |
| אורגון גרין BAPTA-01:00 לצבוע בסידן רגיש | Invitrogen | O6807 | |
| ה-F-127 20% פתרון Pluronic בDMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| confocal מיקרוסקופ הזקוף | אולימפוס | FV300 או FV1000 | |
| מטרות מי טבילה | אולימפוס | LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W / אני (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | סאטר | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| <בקר לחץ/ Td> | פארקר Hannifin | Picospritzer | <3 PSI במהלך יישום |
| פיפטה חולץ | סאטר או Narshige | סאטר P-97 או Narshige PP-830 | |
| pipettes זכוכית | סאטר | BF150-110-10 | ID: 1.10, OD: 1.50 |
| משאבת peristaltic | הרווארד Apparatus | דגם 720 | קצב זרימה: 1 מ"ל / דקה |
| אמבטיה קאמרית | וורנר מכשירים | RC-26 GLP | פרופיל נמוך מאפשר לאישור אובייקטיבי |
| צנור | Tygon | ||
| בקר טמפרטורה | וורנר מכשירים | TC-324B/344B |
טבלה 2. חומרים / רשימת ציוד.
מקורות
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
