מאמר שיטה

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

DOI:

10.3791/4094

⸱

17 בנובמבר 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתחנו מערכת מיקרוסקופ מעקב וידאו שיעור שיכול להקליט ולכמת ג elegans התנהגות ברזולוציה גבוהה ומהירויות גבוהות. יש לנו גם פתחו שיטות חישוביות לצמצום הממדי של תמונות תולעת למערכת יסודית של מדידות המתארות את הצורה של התולעת לחלוטין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתחנו מכשור, עיבוד תמונה, וטכניקות ניתוח נתונים לכמת את התנהגות locomotory של ג elegans כפי שהוא זוחל על פני השטח של צלחת אגרה. לצורך המחקר של בסיס הגנטי, הביוכימי והעצבי של התנהגות, ג elegans הוא אורגניזם אידיאלי כי זה גנטי צייתן, נוח למיקרוסקופיה, ומציג מספר ההתנהגויות מורכבות, כולל מוניות, למידה ו1,2 אינטראקציה חברתיות. ניתוח התנהגותי המבוסס על המעקב אחר התנועות של תולעים כפי שהם זוחלים על צלחות אגרו היה שימושי במיוחד בחקר התנהגות חושית 3, נידות 4, וphenotyping מוטציוני כללי 5. המערכת שלנו פועלת על ידי העברת מערכת המצלמה ותאורה כתולעים זוחלים על צלחת אגר נייחת, מה שמבטיח שאף גירוי מכאני מועבר לתולעת. מערכת המעקב שלנו היא קלה לשימוש וכוללת תכונת כיול אוטומטית למחצה. צ'הllenge של כל מערכות מעקב וידאו הוא שהוא מייצר כמות עצומה של נתונים שבמהותו גבוהה ממדי. עיבוד התמונה שלנו ותוכניות ניתוח נתונים להתמודד עם אתגר זה על ידי הפחתת צורת תולעים לקבוצה של רכיבים עצמאיים, שמשחזרים באופן מקיף את התנהגות התולעים כפונקציה של מידות 3-4 רק 6,7. כדוגמה לתהליך שאנו מראים כי התולעת נכנסה ויוצאת מצב היפוכה באופן ספציפי שלב.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תיאור של מיקרוסקופ מעקב

  1. צלחת אגרה היא מואר על ידי מקור אור סיבים וצלמה עם מצלמה. מערכת זו היא רכובה על X, Y שלב תרגום.
  2. השלב מועבר על ידי stepper מנועים סטנדרטיים, אשר מחוברים לבקר מנוע צעד.
  3. הבקר והמצלמה מחוברים למחשב ונשלטו על ידי תוכניות מותאמות אישית שנכתבו בLabVIEW.
  4. תמונות המצלמה את פני השטח של צלחת אגרה ומזהה עצמים כהים על רקע בהיר.
  5. איכות התמונה היא מותאמת כך תכנית מחשב יכולה לכמת עצמים בזמן אמת. הרווח, הבהירות, ואת מהירות תריס של המצלמה יכולים להיות מותאם כדי לספק אובייקט כהה על רקע לבן.
  6. סימן כיול עבור תהליך הכיול האוטומטי שעל ידי חדירת המשטח אגר במכוש תולעת.
  7. התמונה המסוננת, ינארי המשמש את תכנית המעקב ניתן לבדוק.
  8. כךftware יש תכונה אוטומטי כיול המחשבת את מטריצת הכיול על ידי הזזת אובייקט מבחן מרחק קבוע.
  9. מרחקים בפיקסלים מכוילים לצעדים שננקטו על ידי מנוע הצעד שמטריצת הכיול.
  10. לאחר כיול, המערכת מוכנה ללכת ולא צריכה להיות recalibrated אלא אם הגדלתו השתנתה או שהמצלמה משנה את מיקומו.

2. הכנת צלחות מעקב וג elegans למעקב

  1. טבעת נחושת משמשת לכלוא את התולעים ולשמור אותם לנדוד לשולי הצלחת. הנחושת מספקת מחסום כימי מקומי ואינו משפיעה על התנועה של התולעת אחרת לתקופת הניסוי (<1 שעות). מחמם את הטבעת ראשונה על ידי הצבתו על בלוק חום או שוות ערך.
  2. טבעת מקום על גבי צלחת אגרה טריה (1.7% אגר Bacto, 0.25% Bacto-Peptone, 0.3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 4 המ"מ MgSO, חיץ פוספט אשלגן 25 מ"מ, 5 מיקרוגרם / מ"לכולסטרול) ולחץ כלפי מטה מעט כדי להטביע אותו למשטח אגר.
  3. פיק L4 במה או תולעים צעירים על צלחת אגרה מלאה בכמה חיץ NGM (0.3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 4 המ"מ MgSO, חיץ פוספט אשלגן mM 25) כדי לשטוף מהם את שאריות מזון. תן את התולעים לשחות במשך כמה דקות.
  4. זהירות למקם תולעת אחת לצלחת המעקב בסמוך למרכז הזירה. ולאחר מכן הנח את הלוח על גשש התולעת.

3. מעקב תולעת

  1. הפעל את תכנית LabVIEW ולבחור אפשרויות במידת צורך (מיקום לתמונות, סוגים של תמונות, מדידות, הגדרות מצלמה).
  2. באמצעות הג'ויסטיק להזיז את המיקרוסקופ עד תמונה של התולעת הוא בשדה הראיה (מסך מחשב). לחץ על "מסלול" לעסוק בתכנית המעקב.
  3. תכנית המחשב למעשה מודדת את התנועות של תמונות מסוננות בינאריות כמוצגת, ויכולה לבצע מדידות על התמונה בזמן אמת
  4. בירכתי הספינהאה מעקב שחזור של המסלול הגלובלי יכול להיות עשויים מתנועות stepper המנוע, ואילו שינויי הצורה המקומיות של התולעת שניתן לראות בפירוט.

4. ניתוח נתונים

  1. הפעל את הסקריפט skeletonizing (MATLAB) לparameterize צורות של התולעת. (איור 2)
  2. חישוב eigenmodes של נתוני skeletonized. (איור 3,4)
  3. צג איור 5. קראו אגדת דמות או תוצאות מייצגות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמה: כשהם מחפשים מזון, ג מעברי elegans מקדימה כדי להפוך תנועה, לעתים קרובות ביצוע ארגון מחדש (תור אומגה) לפני ההחזרה למצב התנועה קדימה. כימות המעבר הזה הוא חשוב בהבנת דפוסי האיסוף של תנועה וגם בשליטה המוטורית של התולעת. הכח לחשוף פרטים עדינים של התנהגות תנועה ניתן לראות באמצעות מכשיר המעקב שלנו.

כדוגמה אנחנו מסתכלים קדימה כדי להפוך ולהפוך להעביר מעבר על ידי לכידת תמונות ברזולוציה גבוהה של תולע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של תנועה והתנהגות טבעית דורש טכניקות מעקב בלתי פולשניות בשותף עם טכניקות הפחתת נתונים. כאן יש לנו הפגנו קל לשימוש מערכת מעקב שמתעדת תמונות מפורטות של ג elegans התנהגות כפי שהוא זוחל על פני השטח של צלחת אגרה. כמות המידע שנמצאה בתמונות האלה היא עצומה וגבוה ממדים, וכך גם פתחנו שיטות לצמצום הממדי של הנתונים לתוך רק ארבעה צעדים בסיסיים. צעדים אלו הם מקיפים וקלים לפרש ביחס להתנהגות תולעת. עבור עבודה זו אנו מראים מעבר תולעים שבין קדימה ואחורה קובע מועדף בנקודות שונות במחזו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שמו של החלק חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
מצלמת CCD Basler A601f
עדשה אופטיקה אדמונד MMS סדרה
תאורת סיבים דולן ג'נר DC-950H
שלב תרגום Deltron LS3-4
מנוע צעד דיגיטלי בארה"ב MS23C
מנוע צעדי כונן שממית G201
מנוע צעדי שליטה SimpleStep SSXYZ
כל קוד תכנות זמין. נא לשלוח הודעת דוא"ל עם בקשה למחבר המתאים.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914(2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208(2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegans TrackingWorm TrackerImage ProcessingData AnalysisAgar PlateStepper MotorLabVIEW SoftwareEigen Mode AnalysisBehavioral MeasurementDimensionality Reduction

מאמרים קשורים