הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

18K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4096

⸱

15 ביוני 2012

 , 
1Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

במאמר זה

סיכום

שילוב הדור monodisperse טיפה עם סידור אינרציה של תאים וחלקיקים, אנו מתארים שיטה כדי לתמצת המספר הרצוי של תאים או חלקיקים בטיפה אחת בשיעורים kHz. אנחנו מדגימים את יעילות פעמיים העולה על אלו של אנקפסולציה לא מסודרת עבור טיפות יחיד ו פעמיים החלקיקים.

תקציר

שיטות כמיסו (microfluidic) של כלילה (encapsulation) שימשו בעבר ללכידת תאים בטיפות מימיות מונו-דיספרסיות בקנה מידה של פיקולטר, ובכך סיפקו בידוד מסביבת נוזל רב-מולקולרית עם יישומים בסינון בסביבה בעלת תפוקה גבוהה, ציטומטריה ומספקטרומטריית מסות. אנו מתארים שיטה לא רק לכלילה של תאים בודדים, אלא ללכידה חוזרת של מספר קבוע של תאים (כאן אנו מדגימים כלילה של תא אחד ושני תאים) כדי לחקור הן בידוד והן אינטראקציות בין תאים בקבוצות בגדלים מבוקרים. באמצעות שילוב של טכניקות ליצירת טיפות עם סידור של תאים וחלקיקים, אנו מדגימים כלילה מבוקרת של חלקיקים בגודל של תאים עבור כלילה רציפה ויעילה. באמצעות ת сусפנזיה מימית של חלקיקים ושמן פלואורופחמני שאינו ניתן למסס, אנו מייצרים טיפות מימיות בשמן באמצעות נחיר למיקוד זרימה (flow focusing nozzle). קצב הזרימה המימית גבוה מספיק כדי ליצור סידור של חלקיקים המגיעים לנחיר בתדרים שהם כפולות של מספר שלם של תדר יצירת הטיפות, ובכך נכליל מספר מבוקר של תאים בכל טיפה. לקבלת תוצאות מייצגות, נעשה שימוש בחלקיקי פוליסטירן בגודל 9.9 μm כחליפין לתאים. מחקר זה מראה יעילות כלילה של חלקיק בודד Pk=1 של 83.7% ויעילות כלילה של שני חלקיקים Pk=2 של 79.5%, בהשוואה ליעילויות פואסון (Poisson) המתאימות להם של 39.3% ו-33.3%, בהתאמה. ההשפעה של ריכוז תאים וחלקיקים עקבי הוכחה כבעלת חשיבות מרכזית לכלילה יעילה, וכן נדנו מעברים משיטת טיפות (dripping) לשיטת סילון (jetting).

מבוא

סספנסיות תאים מימיות במצע רציף חולקות סביבה נוזלית משותפת המאפשרת לתאים לקיים אינטראקציה במקביל וגם הומוגניזציה של השפעות תאים ספציפיים במדידות מהמצע. כליאה בנפח גבוה (High-throughput encapsulation) של תאים לתוך טיפות בסדר גודל של פיקוליטר מבודדת את הדגימות כדי להגן על הטיפות מפני זיהום צולב, מאפשרת מדידה של גיוון תאי בתוך הדגימות, מונעת דילול של ריאגנטים וביומרקרים מובעים, ומגבירה אותות מתוצרי ביו-ריאקטור. טיפות מספקות גם את היכולת למזג מחדש טיפות לדגימות מימיות גדולות יותר או עם טיפות אחרות לצורך מחקרי איתות בין-תאי.1,2 ההפחתה בדילול מרמזת על אותות גילוי חזקים יותר למדידות בדיוק גבוה יותר, כמו גם על היכולת להפחית נפחים פוטנציאליים ויקרים של דגימות וריאגנטים.3 כליאת תאים בטיפות נוצלה לשיפור הגילוי של ביטוי חלבונים,4 נוגדנים,5,6 אנזימים,7 ופעילות מטבולית8 לצורך סינון בנפח גבוה, ויכולה לשמש לשיפור ציטומטריה בנפח גבוה.9 מחקרים נוספים מציגים יישומים בביו-אלקטרוספריי (bio-electrospraying) של טיפות המכילות תאים עבור ספקטרומטריית מסות10 וציפויים תאיים ממוקדים של פני שטח.11 עם זאת, חלק מהיישומים הוגבלו בשל חוסר היכולת לשלוט במספר התאים הכלואים בטיפות. כאן אנו מציגים שיטה של כליאה מסודרת12 המגבירה את יעילות הכליאה שהודגמה עבור תא אחד ושני תאים, וניתן להשריג אותה עבור כליאה של מספר גדול יותר של תאים.

כדי להשיג ייצור טיפות מונו-דספרסיות, שיטת "מיקוד זרימה" (flow focusing) מיקרופלואידית מאפשרת יצירת טיפות בגודל נשלט של נוזל אחד (תערובת תאים מימית) בתוך נוזל אחר (פאזה שומנית רציפה), וזאת באמצעות נחיר שבו נפגשים הזרמים.13 עבור גיאומטריה נתונה של הנחיר, ניתן לשנות את תדירות ייצור הטיפות f ואת גודל הטיפה על ידי כיוונון קצבי הזרימה של השמן והמימי Qoil ו-Qaq. ככל שקצבי הזרימה עולים, הזרימות עשויות לעבור מייצור טיפות להספירה (jetting) לא יציבה של הנוזל המימי מהנחיר.14

כאשר התמיסה המימית מכילה חלקיקים תלויים, החלקיקים הופכים למעטופים ומבודדים זה מזה בפתח הנחיר. עבור יצירת טיפות באמצעות תרחיף תאים מימי המפוזר באופן אקראי, השבר הממוצע של טיפות Dk המכילות k תאים נקבע על פי סטטיסטיקת פואסון (Poisson statistics), שבה Dk = λk exp(-λ)/(k!) ו-λ הוא מספר התאים הממוצע לטיפה. השבר של תאים שמגיעים לטיפות המעטופות "נכונה" מחושב באמצעות Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). ההבדל הדק בין שני המדדים הוא ש- Dk מתייחס לנצילות של הנוזל המימי ולכמות המיון של הטיפות שיש לבצע לאחר העטיפה, ו- Pk מתייחס לנצילות של דגימת התאים. לדוגמה, ניתן להשתמש בתרחיף תאים דליל (λ נמוך) כדי לעטוף טיפות שבהן רוב הטיפות המכילות תאים יכילו תא אחד בלבד. בעוד שמדד היעילות Pk יהיה גבוה, רוב הטיפות יהיו ריקות (Dk נמוך), מה שיחייב מנגנון מיון להסרת טיפות ריקות, ובכך יפחית גם את התפוקה.15

שילוב של יצירת טיפות עם מיון אינרציאלי מעניק את היכולת להכניס טיפות לתצלומיות (encapsulate) עם מספר תאים לטיפה צפוי יותר וקצבי תפוקה גבוהים יותר מאשר תצלומיות אקראיות. מיקוד אינרציאלי התגלה לראשונה על ידי Segre ו-Silberberg16 ומתייחס לנטייה של חלקיקים בעלי גודל סופי לנדוד לעמדות שיווי משקל צדדיות בזרימה בתעלה. מיון אינרציאלי מתייחס לנטייה של החלקיקים והתאים להתארגן באופן פסיבי לשורות במרווחים שווים, במבנה מדורג ובמהירות קבועה. הן המיקוד והן המיון דורשים קצבי זרימה גבוהים מספיק (מספר ריינולדס גבוה) וגדלי חלקיקים גדולים מספיק (מספר ריינולדס של חלקיקים גבוה).17,18 כאן, מספר ריינולדס Re =uDh/ν ומספר ריינולדס של חלקיקים Rep =Re(a/Dh)2, כאשר u היא מהירות זרימה אופיינית, Dh [=2wh/(w+h)] הוא הקוטר ההידראולי, ν היא הצמיגות קינמטית, a הוא קוטר החלקיק, w הוא רוחב התעלה ו-h הוא גובה התעלה. באופן אמפירי, האורך הנדרש להשגת שורות ממוינות באופן מלא פוחת ככל ש-Re ו-Rep עולים. יש לשים לב כי הדרישות ל-Re ו-Rep גבוהים (במחקר זה בסדר גודל של 5 ו-0.5, בהתאמה) עשויות להתנגש עם הצורך לשמור על קצבי זרימה מימיים נמוכים כדי למנוע התזת סילון (jetting) בנחיר יצירת הטיפות. בנוסף, קצבי זרימה גבוהים מובילים למאמצי גזירה גבוהים יותר על התאים, נושא שאינו נדון בפרוטוקול זה. מחקר קודם על תצלומיות ממוינות הדגים כי למעלה מ-90% מתאי HL60 שנכנסו לתצלומיות בודדות בתנאי זרימה דומים לאלו שבמחקר זה שמרו על שלמות ממברנת התא.12 עם זאת, יהיה צורך לשקול בזהירות את ההשפעה של סדר הגודל ולוחות הזמנים של מאמצי הגזירה בעת ביצוע אקסטרפולציה לסוגי תאים ופרמטרי זרימה שונים. החפיפה בין המגבלות של קצב הזרימה המימי עבור מיון התאים, יצירת הטיפות וחיוניות התאים מספקת משטר תפעולי אידיאלי לתצלומיות מבוקרת של תאים בודדים ומספר תאים.

מכיוון שמעט מאוד מחקרים עוסקים במרווחים בין רכבות של חלקיקים,19,20 קביעת המרווח מתבצעת בצורה הפשוטה ביותר באופן אמפירי והיא תלויה בגיאומטריית התעלה, בקצב הזרימה, בגודל החלקיקים ובריכוז החלקיקים. עם זאת, מרווח לטראלי שווה בין הרכבות מעיד על כך שהתאים מגיעים במרווחי זמן עקביים וצפויים. כאשר יצירת הטיפות מתרחשת באותו קצב שבו מגיעים תאים מסודרים לדיזה, התאים נכרזים בתוך הטיפה באופן מבוקר. טכניקה זו שימשה לכריזה של תאים בודדים בקצבי עיבוד בסדר גודל של 15 kHz,12 שיפור משמעותי לעומת מחקרים קודמים שדיווחו על קצבי כריזה בסדר גודל של 60-160 Hz.4,15 בעבודת הכריזה המבוקרת, מעל 80% מהטיפות הכילו תא אחד בלבד, שיפור משמעותי ביעילות לעומת סטטיסטיקת פואסון (אקראית), המנבאת יעילות ממוצעת של פחות מ-40%.12

בעבודה קודמת על כליאה מבוקרת,12 כוונן מספר החלקיקים הממוצע לטיפה λ כדי לספק כליאה של תא בודד. אנו משערים כי באמצעות כוונון קצבי הזרימה, ניתן לכלוא ביעילות כל מספר של תאים לטיפה כאשר λ שווה למספר התאים הרצוי לטיפה או קרוב אליו. בעוד שכליאה של תא בודד היא בעלת ערך לקביעת תגובות של תאים 개 개בודדיים לגירויים, כליאה של מספר תאים מספקת מידע הנוגע לאינטראקציה בין מספרים וסוגים מבוקרים של תאים. כאן אנו מציגים פרוטוקול, תוצאות מייצגות באמצעות מיקרוספירות פוליסטרין, ודיון עבור כליאה מבוקרת של תאים מרובים באמצעות תעלת סדר אינרציאלית פסיבית ופיה ליצירת טיפות.

פרוטוקול

הפרוטוקולים בסעיף זה מתארים את החומרים והציוד מנוצל במיוחד על מנת לקבל את תוצאות הניסויים שהוצגו. שימו לב ספקים חלופיים כימיקלים וציוד עשוי להיות מנוצל.

1. המכשיר ייצור ליתוגרפיה Soft

תקן טכניקות ליתוגרפיה רך, 21 במספר אשר הוצגו במאמרים קודמים יופיטר, 22 שימשו ליצירת polydimethylsiloxane (PDMS) רשתות מלוכדות microchannel מצעים זכוכית. מלבד ייצור העתק עובש על ידי אמן photolithography SU-8, התהליכים ניתן לבצע מחוץ לחדר נקי או מכסה המנוע נקי, עם זאת, אבק וחלקיקים עדיין צריך להיות ממוזער כדי להשיג תוצאות עקביות.

  1. עיצוב דפוס ערוץ מיקרו כפי שמוצג באיור 1 ב-AutoCAD (Autodesk Inc). מעסיקים יצרנית צד שלישי (Fineline הדמיה בע"מ) להדפיס ברזולוציה גבוהה (50,000 dpi) טרנסparency המסכה על הסרט מיילר או קוורץ שבו ערוצי שקופים על רקע כהה.
  2. צור סיליקון SU-8 עבור דפוס מאסטר photoresist העתק. בקיצור, ספין SU-8 2050 (MicroChem) photoresist שלילית עם סל"ד מומלץ של היצרן על coater ספין כדי ליצור שכבה עבה על 52 מיקרומטר כמה 7.5 ס"מ נקיים או 10 פרוסות סיליקון ס"מ. לאחר לאפות רך, EDGE הסרת חרוז, חשיפה UV דרך מסכה של איש קשר, שלאחר החשיפה לאפות, פיתוח, וחשיפה המבול, למדוד את עובי שכבת בפועל של 8-SU באמצעות profilometer Dektak (Veeco). סרט עובש אמן על החלק התחתון של התבשיל 4 "או 5" פטרי להתכונן דפוס העתק PDMS.
  3. מערבבים PDMS בסיס אלסטומר עם סוכן אלסטומר ריפוי (Dow Corning) ב 10:01 בסיס יחס W / ל לסוכן ריפוי. יוצקים גם מעורב מבשר PDMS על המאסטר סיליקון כדי ליצור שכבה 2-3 מ"מ עובי הסופי. תערובת של בסיס 20 גרם אלסטומר עם סוכן גרם 2 ריפוי מספיק כדי לכסות 4 "פני קוטר.
  4. מניחים את master עובש PDMS ב תא ייבוש ואקום (Jencons) לדה גז PDMS דפוקה. באמצעות ווסת לחץ (קול בן הזוג), לאט לאט להפחית את מד תא לחץ של 0 "כספית ל -27" כספית מעל 20 דקות, כדי למנוע עודף קצף. השאירו המכשיר בתא ואקום ב -27 "כספית במשך 30 דקות או עד בועות אוויר להיעלם.
  5. לשחרר ואקום ולעבור עובש אב PDMS ל 65 מעלות צלזיוס בתנור (Thermo Scientific) לתקופה של ארבע שעות. המכשיר ניתן להשאיר בתנור למשך הלילה כדי לשפר ריפוי.
  6. הסר את ההתקן מהתנור להתקרר. חותכים בזהירות סביב PDMS רקיק עגול בעזרת סכין דיוק לקלף את PDMS. לחתוך את קווי המתאר מכשיר כפי שמוצג באיור 1 עם אזמל.
  7. פונץ fluidic יציאות (3 לכל מכשיר) בשלוש אזורים עגולים שמוצג באיור 1 באמצעות אגרוף ביופסיה. עבור התקן זה, השתמש 0.75 מ"מ קוטר חיצוני אגרוף (האריס).
  8. לדבוק נייר דבק לצד בדוגמת של PDMS וקליפת להסיר כלאבק. כחלופה עלות חיסכון, אך מעשית מנגנוני פלזמה קונבנציונאלי חמצן, 21,22 פלזמה לטפל בצד בדוגמת של PDMS ו 3 נקי "x 1" מיקרוסקופ שקופיות הזכוכית באמצעות יד שנערך במעבדה קורונה treater (אלקטרו טכני מוצרים בע"מ .). 23 שים לב, כי למכשיר יש להשתמש במנדף או מאוורר היטב בשטח עקב הפרשות האוזון, וכל שעונים וטלפונים סלולריים יש לשמור לפחות עשרה מטרים. התאמת הפרשות קורונה להשיג קורונה יציב עם מינימלי מעוררת. לאט לאט לנופף האלקטרודה על 1/4 "מעל פני השטח כל אחד במשך כ 20 שניות ואז מיד להחזיר את המשטחים שטופלו במגע ליצור קשר קבוע וחזק לפני משטחי PDMS לחזור למצב הטבעי שלהם.
  9. מניחים את המכשיר על צלחת מתכת, ומכניסים לתנור קר, להגדיר את התנור ל 120 מעלות, ואופים במשך הלילה כדי להשלים מליטה לחזור PDMS למצב הידרופובי המקורי. 24 במהלך האפייה זה חום גבוה, לאהוא משטח הזכוכית של הערוץ יהיה גם שניתנו הידרופובי בשל בתצהיר של שכבת הידרופובי דקה על זכוכית. לחלופין, ציפוי הידרופובי כגון Aquapel (PPG Industries) ניתן להזריק לתוך השקעים fluidic באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט המזרק. 12 בזהירות אך בתקיפות להזריק Aquapel ואחריו טיהור אוויר לתוך השקעים fluidic בלי לשבור את PDMS לכוס בונד . באגרסיביות לחזור על טיהור אוויר בכל יציאות כניסת ו לשקע תוך מוחה את כל Aquapel עודף על מנת למנוע כל פיקדונות שעלולים לסתום את הערוצים על גבי ייבוש.

2. לדוגמא הכנת

  1. להכין תרבית תאים בהתאם לנהלים שנקבעו עבור סוג שבחרת התא. עבור מכשיר מסוים נעשה שימוש במחקר זה, 8-15 חלקיקים מיקרומטר או תאים צריך במידה מספקת להורות אנקפסולציה. סוגי תאים קטנים יותר או גדול יותר עשויים לדרוש שינוי הממדים של ערוץ התמקדות להשיג עמ 'Re הולם. עבור ליתוצאות ההפגנה thod המוצג במאמר זה, קלקר 9.9 מיקרומטר microspheres (G1000, Thermo Scientific) מנוצלים כמו המחליפים סלולריים.
  2. מכינים את החלקיק מימית או ההשעיה התא באמצעות ערבוב עדין. בעת שימוש תאים או חלקיקי פוליסטירן, שליטה וריכוז חיוני (ראה איור 4) כדי להשיג אנקפסולציה הורה אידיאלי. שימוש בנתונים הקודמים 12 כמדריך, לחשב את התא הרצוי או ריכוז החלקיקים מבוסס על המרווח הרכבת הורה וגודל מיקרו ערוצים כמו: תא אחד או החלקיקים הצפויים לכל אורך המרווח פעמים רכבת התמקדות חתך באזור הערוץ. אם ריכוז המניות (1% w / w) אינה מספקת, להגביר את הריכוז (כאן 1.5% w / w) על ידי בעדינות צנטריפוגה מדגם המניות, הסרת נוזל supernatant, מחדש השעיית חלקיקים על ידי מערבולת ערבוב, או ערבוב עדין בעת השימוש בתאים. הכן נפח מספיק כדי להסביר את עוצמת אוסף הרצוי במשך זמן ריצה הקשורים FLow כוונון.
  3. שני תאים וחלקיקים פוליסטירן יש משקל סגולי גדול מ 1. אמנם לא הפגינו פרוטוקול זה, לטווח הארוך ניסויים שנמשכו בסדר גודל של דקות ארוכות עד שעות, הציפה להתאים את הפתרון על ידי הוספת המומס כגון CaCl 2 עבור חלקיקים או OptiPrep (Sigma-Aldrich) של תאים.
  4. הכן מדגם 10 מ"ל של שלב fluorocarbon רציפה הנפט על ידי ערבוב שמן fluorocarbon FC-40 (3M) ו-PEG PFPE לחסום פעילי שטח קופולימר 25 (2.5% w / w) (RainDance טכנולוגיות) בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לחלופין, שמן מינרלי אור (כימיקלים PTI התהליך) יכול להיות מנוצל עם פעילי שטח 90 ABIL-EM (2.5% w / w) (Evonik גולדשמידט Corporation).

3. ניסויי ההתקנה

  1. כוח על מיקרוסקופ אופטי הפוכה (Axio אובזרוור, Zeiss) ואת המצלמה במהירות גבוהה (פנטום V310, Vision Research). להתמקד ולבדוק את הערוצים עבור כפכפים ופסולת באופן ידני על ידי הזזת המכשיר אובאמצעות מיקרוסקופ ממונע הבמה. פסולת כמה קטן יכול להיות דחף החוצה כאשר נוזל זורם. עבור פסולת גדולה או כפכפים ברורות, בחר ערוץ אחר במכשיר כמו פסולת בערוץ התמקדות יכול לפגוע משמעותית באיכות ההזמנה. שים לב, כפכפים לעתים קרובות ניתן להסיר תחת זרם על ידי לחיצה היטב על פני השטח PDMS מעל האזור הפגוע עם פינצטה קהים.
  2. חותכים שלושה אורכי צינורות PVC (0.01 "ID/0.03" OD, Tygon) עבור כניסת מימית, כניסת שמן, וכן עודפים אמולסיה. כדי למזער את נפח מת, לחתוך מספיק צינורות להגיע מן משאבות מזרק לשלב את המיקרוסקופ. לחתוך קצוות צינורות בזווית של 45 מעלות כדי להקל על הכניסה לתוך יציאות fluidic.
  3. להשתמש בפינצטה ללחוץ להתאים צינור מסתיים לתוך השקעים fluidic אגרוף בשלב 1 ולאחר מכן הקש להכיל שני 30 בוטה, קצה מד חלד מזרק מחטים פלדה (SmallParts) את הקצוות החופשיים של מימית המתאימה ואת כניסת צינורות נפט (אין צורך דבק) . מניחים את צינורות מוצא אל R פסולתeservoir. צינור זה יהיה מאוחר יותר נכנסו למאגר אוסף.
  4. העבר את המכשיר צינורות המצורפת לשלב את המיקרוסקופ, ליישר, ולהתמקד זרבובית את המכשיר באמצעות המטרה זמין (20x שימש לצורך ניסוי זה). כוונן עבור K hler תאורה והגדרות מיקרוסקופ אחרים כנדרש הקלטה אופטימלית.
  5. מלא את המזרק 1 מ"ל (BD) עם שלב היטב מעורבת מימית ו מזרק 3 מ"ל (BD) עם פתרון הנפט בשלב מוכן בשלב 2. שים לב כי כל מזרקים של כל אמצעי אחסון ניתן להשתמש ויש שנבחרו בקפידה בהתאם לרוץ פעמים הרצויים וצמצום pulsatility כלשהו. הטה 1 המזרק במאונך קפיצי לעבור בועות אוויר לשקע את המזרק. לאט לאט לדכא את הבוכנה עד כדי לדחוף את האוויר עד קצה המזרק. מחזיק את המזרק במאונך, לחבר את המזרקים כדי מחט המזרק בהתאמה המצורפת למכשיר כבר בשלב 3.3. לדכא את הבוכנה של חיל האוויר באמצעות מחט המזרק נפח הנוזל הוא מת עד עמ 'ushed דרך צינורות כמעט למכשיר. מאובטח לעלות את המזרק משאבת מזרק (Nexus 3000, Chemyx) ועוסקים גוש הבוכנה. חזור על קשרים מזרק 2 ו הר משאבת מזרק 2.
  6. הפעל את המשאבה בכל מזרק התוכנית באמצעות פרוטוקולים היצרן של המשאבה. הגדר את ספיקות הראשונים ש שמן = 50 μL / דקה ו-Q aq = 5 μL / דקה לשלב את השמן בשלב מימית, בהתאמה. התחל את המשאבות.
  7. חכו נוזל זה להיכנס למכשיר ולמלא את הערוצים, דוחף את האוויר המת הנותרים. זה עשוי להימשך מספר דקות. אם יש כמות גדולה של אוויר בצינור היניקה, להגדיל באופן זמני את כל קצב הזרימה עד האוויר מסולק. לא להגדיל את ספיקות גבוהות, כך הלחץ גדול להופיע בערוץ, שעלול לכישלון PDMS אל הכוס בונד.
  8. באמצעות ספיקות ראשוניים, לצפות את היווצרות טיפות בכל נחיר (תוצאות המוצג כאן: 20x magnification, מסגרת הדולר 21005 תמונות בשניה, חשיפה 3 μs). להפחית את השדה במצלמה מבט אל הנחיר רק כדי למקסם את המסגרת הדולר ולצמצם את דרישות הזיכרון אם אפשר. לכידת וידאו מדגם ולוודא כי קצב הדגימה הוא מספיק כדי למנוע aliasing.
  9. כדי למנוע הטיסות הללו (ראה איור 2), להתחיל עם ספיקה נמוכה מימיות. לאט לאט להגביר את קצב זרימת מימית לקיים סדר חלקיקים בערוץ פתרון ארוך מימית כמו עליית קצב הזרימה.
  10. אם ריכוז החלקיקים היא נמוכה מכדי לספק רכבות עם מספר קטן יחסית של חלקיקים "נעדר" מדגם לא ציפה בהתאמה, פיזית להטות את משאבת מזרק לכיוון מוצא את המזרק על מנת לספק ליישוב הדרגתית של חלקיקים לכיוון מוצא את המזרק. שיטה זו באה לידי ביטוי בפרוטוקול וידאו. מדי פעם לסובב את המזרק לאורך הציר שלה עשוי גם להפחית התיישבות בלתי רצויה.
  11. לאחר סידור הולם מתרחשת, להתאים את קצב זרימת הנפט לכוון את תדר הדורגודל הטיפות. היקף הירידה הממוצע יכול להיות מחושב לפי שער זרימת מימית חלקי התדר ירידה הדור כפי שנמדד על ידי לכידת וידאו. חוזרת לשנות את שתי ספיקות להשיג שיעורי אנקפסולציה הרצויות ואמצעי אחסון ירידה.
  12. אנקפסולציה הורה יציב פעם הוא אישר, להעביר את צינור מוצא מן המאגר פסולת אל תוך המאגר אוסף או להאכיל אותו למכשיר אחר לבדיקה שלאחר מכן.
  13. קבע את זמן איסוף מבוסס על המספר הרצוי של טיפות ותדירות הדור מחושב.
  14. להקליט את החלק היחסי של טיפות המכילות 0, 1, 2, ..., N חלקיקים לכמת את היעילות באמצעות בין אם הדור ירידה בתוצאות וידאו או pipetting מדגם של תחליב נאסף לבדיקה.

4. נציג תוצאות

תוצאות מוצגים בו גם להשיג שליטה יחיד החלקיקים ומבוקר פעמיים החלקיקים אנקפסולציה (איור 3). על ידי חיתוך קצב הזרימה FC-40 שמן 1/2, חד החלקיקים אנקפסולציה הופך שני החלקיקים אנקפסולציה. לעומת זאת, נוכל הגדילו את קצב הזרימה מימית כדי לספק חלקיקים זרבובית מהר יותר, אבל אנחנו גם לא הגדילו את הסיכון המתפרצת של הנחל מימית. היסטוגרמות באיור 3 מציגים את מספר השבר של חלקיקים בכל ירידה של שני המקרים, יחד עם ההשוואות פואסון לסטטיסטיקה. טיפות מדי פעם עם אפס חלקיקים הם בעיקר בשל חלקיקים "חסרים" ב הרכבות שהוזמנו, ואילו במקרים בהם ישנם חלקיקים כמוס יותר מאשר התוצאה הרצויה מן המקומיים ריכוזים גבוהים של חלקיקים וחלקיקים שלעתים נודדים לעבר אחד משני תפקידים התמקדות אנכיים. שים לב, הציפה התאמה כמתואר בסעיף 2 לא נוצל. במקום זאת, משאבת מזרק היה מוטה באופן פיזי כדי לאפשר יישוב של חלקיקים לכיוון מוצא את המזרק, מה שמוביל לריכוז גבוה של חלקיקים בזמן הריצה.

class = "jove_content"> ריצה הניסוי מדגים את הצורך חלקיק נכונה ריכוזי תאים מוצגת באיור 4. ללא הזמנה מלאה, קבוצות מקומיות של הסדר חלקיקים כמוסות, אבל טיפות רבות ללא חלקיקים. ההיסטוגרמה מראה את היעילות אנקפסולציה ירד אנקפסולציה 2 הרצויה החלקיקים.

figure-protocol-1
באיור 1. מכשיר Encapsulation. א) המכשיר כולל עם פתחי הכניסה, לשקע, ואת ערוץ הזמנת רב. גובה המכשיר הוא 52 מיקרומטר ורוחב הערוץ מזמין הוא 27 מיקרומטר. ב) גם מימית וגם פתחי הכניסה הנפט מסננים פסולת גדולות עם פערים בסדר גודל של רוחב הערוץ מזמין עבור תצוגה מוגדלת של כניסת שמן. ג) צפה זרבובית מוגדלת מראה רוחבי שווה של ערוץ 27 מיקרומטר עבור ערוצי מימית, שמן, ואחריו התכווצות זרבובית של 22 מיקרומטר והרחבת הפתאומית לערוץ רחב יותר מיקרומטר 61.שים לב, את מידותיו של המכשיר המוצג כאן אומתו באמצעות profilometer לאחר microfabrication ו שונה במקצת את ממדי נומינליים על המסכה. התמונה האמיתית של הערוץ מזמין ו זרבובית זמינים באינטרנט כמו איור משלימה 1 . קובץ AutoCAD המסכה יש גם כלל באינטרנט כתוספת כתב היד הזה.

figure-protocol-2
איור 2. Hysteresis של נוטף המעבר המתפרצת באמצעות מכשיר רחב יותר (80 מיקרומטר רחב x 22 מיקרומטר גבוהה). א) בקצב FC-40 זרם בלתי פוסק (ש שמן = 45 μL / min), יצירת ירידה מתמדת מתרחשת kHz 10 באמצעות שיעור מימית זרימת ש aq = 8 μL / דקה. כמו קצב זרימת מימית הוא גדל לאט עד 10 & MU, L / min, המתפרצת של זרם נוזל מימי מופעל. ב) כאשר קצב זרימת מוחזר μL 8 / דקה הטיסות הללו ממשיך. שים לב, היווצרות ירידה קבועה ניתן הוקמה מחדש על ידי לחיצה קצרה הפסקה משאבת זרימה מימית (להשהות 1 2 אופייני).

figure-protocol-3
איור 3. אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים. היווצרות) Drop עם תא אחד לכל ירידה (Q שמן = 60 μL / דק ', ש aq = 9 μL / min) עם שיעור ירידה של הדור kHz 6.1, גודל ירידה ממוצעת של 24.4 PL, וכמה מתא בודד יעילות לכידת D k = 79.5% ו P K = 83.7% (λ = 0.95) עבור גודל מדגם של n = 517 טיפות ד ו n p = 491 חלקיקים. ב) היווצרות Drop עם שני תאים לכל ירידה מושגת רק על ידי צמצום FC-40 קצב הזרימה נפט ל -30 ש μ L / min. גדולים יותר (39.8 את PL) נוצרות טיפות בשיעור של 3.8 kHz ביעילות 2 תאים לכידת D k = 71.5% ו P K = 79.5% (λ = 1.80) עבור גודל מדגם של n D = 383 טיפות ו-N p = 689 חלקיקים. CD) שתי היסטוגרמות להשוות את אנקפסולציה ירידה החלקיקים יעילות D K של אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים הורה עם Poisson לסטטיסטיקה (אנקפסולציה אקראית). שים לב שעבור המקרים, מרווח בין החלקיקים לכיוון הזרימה היא כ 17-18 מיקרומטר עבור חלקיקים, הורה באופן מלא לסירוגין. קטעי וידאו משלימים מראה גם אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים זמינים באופן מקוון. לחץ כאן כדי להציג סרט תוספת 3 א . לחץ כאן כדי להציג סרט תוספת 3 ב .

התחת = "jove_content"> figure-protocol-4
ריכוז איור 4. מאוד משפיע על יעילות אנקפסולציה.) כמו ירידה הריכוז, סידור מלא אינו מתרחש, ובכך "חורים" של הרכבות לצאת, לצאת כמה טיפות עם פחות מ חלקיקים צפויים. ב) ההיסטוגרמה מראה את יעילות ירידה ( D k = 55.9%, P k = 70.9%) אנקפסולציה של שני החלקיקים בשל הערך הנמוך של λ = 1.57 שם יש כמעט אותו מספר חלקיק יחיד טיפות כמו שיש פעמיים החלקיקים טיפות. התוצאה היא דמות שמן ש = 30 μL / דקה ו-Q aq = 9 μL / דקה, תנאי הזרימה זהה איור 3 ב. וידאו משלים נציג זמין באינטרנט. לחץ כאן כדי להציג סרט משלימה 4 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות תארים גבוהים יחסית של ההזמנה, לא טיפות כל יכיל את מספר נכון של חלקיקים או תאים. יעילות Encapsulation יכול להיות מחושב על פי מספר התאים או חלקיקים שהפכו הגלום טיפות עם תפוסה הרצוי חלקי המספר הכולל שלהם. נתונים אלה גלם ניתן להשיג גם מן האלגוריתם וידאו אוטומטית במהירות גבוהה או הדמיה מדגם של תחליב אסף. הדבר משול לשבר של חלקיקים P k הגלום ירידה המכיל חלקיקים K ו את החלק היחסי של טיפות D K שיהיה בה חלקיקים יא. מ איור 3, הן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

י"א הוא ממציא על הפטנט תלויה ועומדת מבוסס על טכנולוגיה מנוצל כתב היד הזה.

תודות

אנו מודים RainDance טכנולוגיות למדגם של פעילי שטח PFPE-PEG שימוש במחקר זה, ואנו מודים משאבים BioMEMS מרכז (מהמט טונר, מנהל) על תבנית סיליקון פרוסות סיליקון המשמשת ליצירת העתקים PDMS הערוץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
AutoCAD Autodesk
שקיפות מסכה Fineline הדמיה בע"מ
SU-8 photoresist MicroChem 2050
Dektak Profilometer Veeco
צלחת פטרי BD פלקון 351058
PDMS סיליקון ערכת אלסטומר Dow Corning קורפ Sylgard 184, מספר חומרים (240) 4019862
אבק תא ייבוש Jencons 250-030
משאבת ואקום אלקטל טכנולוגיה אבק 2010 C2
אבק הרגולטור קולמן בן הזוג EW-00910-10
תנור Thermo Scientific לינדברג כחול M, OV800F
ביופסיה, 0.75 מ"מ האריס Uni-Core 15072
המעבדה קורונה Treater אלקטרו טכני מוצרים בע"מ BD-20AC, מק"ט 12051A
שקופיות הזכוכית חותם זהב 3010
Aquapel PPG Industries אסטרטגיה אלטרנטיבית
פוליסטירן microspheres, 9.9 מיקרומטר Thermo G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 לא הפגינו
Luer-Lok מזרקים BD 1 מ"ל: 309628
3 מ"ל: 309585
FC-40 fluorocarbon שמן 3M בע"מ סיגמא אולדריץ', F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance טכנולוגיות
אור שמן מינרלי PTI כימיקלים בתהליך 08042-47-5 אסטרטגיה אלטרנטיבית
שמן מינרלי פעילי שטח Evonik גולדשמידט Corporation ABIL EM 90 אסטרטגיה אלטרנטיבית
Tygon צינורות PVC SmallParts TGY-010
30 Luer-Lok מד מחט מזרק, 1/2 " SmallParts לא זמיןE-301PL-C
הפוך מיקרוסקופ Carl Zeiss הדמיה Axio Observer.Z1
במהירות גבוהה מצלמה Vision Research פנטום V310
מזרק משאבות (2) Chemyx בע"מ Nexus 3000
שמן סיליקון Dow Corning 200 נוזל, 10 CST אופציונלי עבור אחסון אמולסיה

מקורות

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001(2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364(2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703(2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319(2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

כמוסה מיקרופלואידיתנחיר מיקוד זרימהסידור אינרציאליכליאת תא בודדכליאת שני תאיםתחליפי חלקיקיםקצב ייצור טיפותספיקת זרימה מימיתספיקת זרימה של שמןכליאה מבוקרת
קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.