$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
שיטות אנקפסולציה מיקרופלואידיות שימשו בעבר כדי ללכוד תאים בטיפות מימיות מונודיסטריות בקנה מידה פיקוליטר, המספקות כליאה מסביבת נוזל בתפזורת עם יישומים בהקרנת תפוקה גבוהה, ציטומטריה וספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטה לא רק לעטוף תאים בודדים, אלא ללכוד שוב ושוב מספר מוגדר של תאים (כאן אנו מדגימים אנקפסולציה של תא אחד ושני תאים) כדי לחקור הן את הבידוד והן את האינטראקציות בין תאים בקבוצות בגדלים מבוקרים. על ידי שילוב טכניקות יצירת טיפות עם סדר תאים וחלקיקים, אנו מדגימים אנקפסולציה מבוקרת של חלקיקים בגודל תא לאנקפסולציה יעילה ורציפה. באמצעות תרחיף חלקיקים מימי ושמן פלואורוקרבון בלתי ניתן לערבוב, אנו מייצרים טיפות מימיות בשמן עם זרבובית מיקוד זרימה. קצב הזרימה המימי גבוה מספיק כדי ליצור סדר של חלקיקים המגיעים לזרבובית בתדרים מרובים שלמים של תדר יצירת הטיפה, המכילים מספר מבוקר של תאים בכל טיפה. לקבלת תוצאות מייצגות, חלקיקי פוליסטירן של 9.9 מיקרומטר משמשים כתחליפים לתאים. מחקר זה מראה יעילות אנקפסולציה של חלקיק יחיד Pk=1 של 83.7% ויעילות אנקפסולציה של חלקיקים כפולים Pk=2 של 79.5% בהשוואה ליעילות פואסון של 39.3% ו-33.3%, בהתאמה. ההשפעה של ריכוז עקבי של תאים וחלקיקים הוכחה כבעלת חשיבות רבה לאנקפסולציה יעילה, ומטופלים גם מעברי טפטוף לסילון.
מבוא
מתלי תאים מימיים של מדיה רציפה חולקים סביבת נוזל משותפת המאפשרת לתאים לקיים אינטראקציה במקביל וגם הומוגניזציה של ההשפעות של תאים ספציפיים במדידות מהתקשורת. אנקפסולציה בתפוקה גבוהה של תאים לטיפות בקנה מידה פיקוליטר מגבילה את הדגימות כדי להגן על טיפות מפני זיהום צולב, לאפשר מדידה של גיוון תאי בתוך דגימות, למנוע דילול של ריאגנטים וסמנים ביולוגיים מבוטאים, ולהגביר אותות ממוצרי ביו-ריאקטור. טיפות מספקות גם את היכולת למזג מחדש טיפות לדגימות מימיות גדולות יותר או עם טיפות אחרות למחקרי איתות בין-תאיים. 1,2 ההפחתה בדילול מרמזת על אותות זיהוי חזקים יותר למדידות דיוק גבוהות יותר, כמו גם על היכולת להפחית נפחי דגימה וריאגנטים שעלולים להיות יקרים. 3 אנקפסולציה של תאים בטיפות שימשה לשיפור זיהוי ביטוי החלבון,4 נוגדנים,5,6 אנזימים,7 ופעילות מטבולית8 לבדיקת תפוקה גבוהה, ויכולה לשמש לשיפור ציטומטריה בתפוקה גבוהה. 9 מחקרים נוספים מציגים יישומים בביו-אלקטרו-ריסוס של טיפות המכילות תאים לספקטרומטריית מסה10 וציפויים ממוקדים של תאי שטח. 11 עם זאת, יישומים מסוימים הוגבלו בשל היעדר היכולת לשלוט במספר התאים העטופים בטיפות. כאן אנו מציגים שיטה של אנקפסולציה מסודרת12 המגדילה את יעילות האנקפסולציה המוכחת עבור תא אחד ושניים וניתן להפיק אקסטרפולציה עבור אנקפסולציה של מספר גדול יותר של תאים.
כדי להשיג יצירת טיפות מונו-דיספרס, "מיקוד זרימה" מיקרופלואידית מאפשר יצירת טיפות בגודל נשלט של נוזל אחד (תערובת תאים מימית) בתוך נוזל אחר (פאזה רציפה של שמן) על ידי שימוש בזרבובית שבה הזרמים מתכנסים. 13 עבור גיאומטריית זרבובית נתונה, ניתן לשנות את תדר יצירת הטיפות f וגודל הטיפה על ידי התאמת קצבי הזרימה של שמן ומימיים Qו-Q aq. ככל שקצב הזרימה גדל, הזרימות עשויות לעבור מיצירת טיפות לסילון לא יציב של נוזל מימי מהזרבובית. 14
כאשר התמיסה המימית מכילה חלקיקים תלויים, החלקיקים נעטפים ומבודדים זה מזה בזרבובית. עבור יצירת טיפות באמצעות תרחיף תאים מימי המפוזר באופן אקראי, החלק הממוצע של טיפות Dk המכילות k תאים מוכתב על ידי סטטיסטיקת פואסון, כאשר Dk = λk exp(-λ)/(k!) ו-λ הוא מספר התאים הממוצע לטיפה. חלק התאים שמגיעים לטיפות העטופות "כהלכה" מחושב באמצעות Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). ההבדל העדין בין שני המדדים הוא ש-Dk מתייחס לניצול הנוזל המימי ולכמות מיון הטיפות שיש להשלים לאחר האנקפסולציה, ו-Pk מתייחס לניצול דגימת התא. כדוגמה, אפשר להשתמש בתרחיף תאים מדולל (λ נמוך) כדי לעטוף טיפות שבהן רוב הטיפות המכילות תאים יכילו תא אחד בלבד. בעוד שמדד היעילות Pk יהיה גבוה, רוב הטיפות יהיו ריקות (Dk נמוך), ובכך ידרוש מנגנון מיון להסרת טיפות ריקות, וגם יפחית את התפוקה. 15
שילוב של יצירת טיפות עם סדר אינרציאלי מספק את היכולת לעטוף טיפות עם מספר צפוי יותר של תאים לטיפה ותפוקות גבוהות יותר מאשר אנקפסולציה אקראית. מיקוד אינרציאלי התגלה לראשונה על ידי סגרה וסילברברג16 ומתייחס לנטייה של חלקיקים בגודל סופי לנדוד למצבי שיווי משקל רוחבי בזרימת הערוץ. סדר אינרציאלי מתייחס לנטייה של החלקיקים והתאים להתארגן באופן פסיבי לרכבות מהירות קבועות במרווחים שווים. גם המיקוד וגם הסדר דורשים קצבי זרימה גבוהים מספיק (מספר ריינולדס גבוה) וגדלי חלקיקים (מספר חלקיקים ריינולדס גבוה). 17,18 כאן, מספר ריינולדס Re = uDh/ν ומספר ריינולדס של החלקיק Rep = Re(a/Dh)2, כאשר u היא מהירות זרימה אופיינית, Dh [=2wh/(w+h)] הוא הקוטר ההידראולי, ν הוא הצמיגות הקינמטית, a הוא קוטר החלקיקים, w הוא רוחב הערוץ, ו-h הוא גובה הערוץ. מבחינה אמפירית, האורך הנדרש להשגת רכבות מסודרות במלואן פוחת ככל ש-Reו-Re p עולים. שימו לב שהדרישות הגבוהות של Re ו-Rep (למחקר זה בסדר גודל של 5 ו-0.5, בהתאמה) עשויות להתנגש עם הצורך לשמור על קצבי זרימה מימיים נמוכים כדי למנוע סילון בזרבובית ייצור הטיפה. בנוסף, קצבי זרימה גבוהים מובילים למתחי גזירה גבוהים יותר על התאים, שאינם מטופלים בפרוטוקול זה. מחקר האנקפסולציה הקודם שהוזמן הראה כי למעלה מ-90% מתאי HL60 עטופים בודדים בתנאי זרימה דומים לאלה במחקר זה שמרו על שלמות קרום התא. 12 עם זאת, יהיה צורך לשקול בזהירות את ההשפעה של סולמות הגודל והזמן של מתחי גזירה בעת אקסטרפולציה לסוגי תאים ופרמטרים שונים של זרימה. החפיפה של אילוצי קצב הזרימה המימית של סדר התאים, יצירת הטיפות וכדאיות התא מספקת משטר תפעולי אידיאלי לאנקפסולציה מבוקרת של תאים בודדים ומרובים.
מכיוון שמעט מאוד מחקרים עוסקים בריווח רכבות בין חלקיקים,19,20 קביעת המרווח נעשית בצורה האמפירית ביותר ותהיה תלויה בגיאומטריית הערוץ, קצב הזרימה, גודל החלקיקים וריכוז החלקיקים. עם זאת, המרווח הרוחבי השווה בין הרכבות מרמז על כך שהתאים מגיעים למרווחי זמן צפויים ועקביים. כאשר יצירת טיפות מתרחשת באותו קצב שבו תאים מסודרים מגיעים לזרבובית, התאים נעטפים בתוך הטיפה בצורה מבוקרת. טכניקה זו שימשה לעטיפת תאים בודדים עם תפוקה בסדר גודל של 15 קילו-הרץ,12 שיפור משמעותי לעומת מחקרים קודמים שדיווחו על שיעורי אנקפסולציה בסדר גודל של 60-160 הרץ.4,15 בעבודת האנקפסולציה המבוקרת, למעלה מ-80% מהטיפות הכילו תא אחד ויחיד, שיפור משמעותי ביעילות לעומת סטטיסטיקת פואסון (אקראית). מה שמנבא פחות מ-40% יעילות בממוצע. 12
בעבודת אנקפסולציה מבוקרת קודמת,12 המספר הממוצע של חלקיקים לטיפה λ כוון לספק אנקפסולציה של תא בודד. אנו משערים שבאמצעות כוונון קצבי הזרימה, אנו יכולים לעטוף ביעילות כל מספר תאים לטיפה כאשר λ שווה או קרוב למספר התאים הרצוי לטיפה. בעוד שאנקפסולציה של תא בודד היא בעלת ערך בקביעת תגובות תאים בודדים מגירויים, אנקפסולציה מרובת תאים מספקת מידע הנוגע לאינטראקציה של מספרים וסוגי תאים מבוקרים. כאן אנו מציגים פרוטוקול, תוצאות מייצגות באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן, ודיון לאנקפסולציה מבוקרת של תאים מרובים באמצעות ערוץ סדר אינרציאלי פסיבי וזרבובית ליצירת טיפות.