קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

Summary

שילוב הדור monodisperse טיפה עם סידור אינרציה של תאים וחלקיקים, אנו מתארים שיטה כדי לתמצת המספר הרצוי של תאים או חלקיקים בטיפה אחת בשיעורים kHz. אנחנו מדגימים את יעילות פעמיים העולה על אלו של אנקפסולציה לא מסודרת עבור טיפות יחיד ו פעמיים החלקיקים.

Abstract

שיטות אנקפסולציה מיקרופלואידיות שימשו בעבר כדי ללכוד תאים בטיפות מימיות מונודיסטריות בקנה מידה פיקוליטר, המספקות כליאה מסביבת נוזל בתפזורת עם יישומים בהקרנת תפוקה גבוהה, ציטומטריה וספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטה לא רק לעטוף תאים בודדים, אלא ללכוד שוב ושוב מספר מוגדר של תאים (כאן אנו מדגימים אנקפסולציה של תא אחד ושני תאים) כדי לחקור הן את הבידוד והן את האינטראקציות בין תאים בקבוצות בגדלים מבוקרים. על ידי שילוב טכניקות יצירת טיפות עם סדר תאים וחלקיקים, אנו מדגימים אנקפסולציה מבוקרת של חלקיקים בגודל תא לאנקפסולציה יעילה ורציפה. באמצעות תרחיף חלקיקים מימי ושמן פלואורוקרבון בלתי ניתן לערבוב, אנו מייצרים טיפות מימיות בשמן עם זרבובית מיקוד זרימה. קצב הזרימה המימי גבוה מספיק כדי ליצור סדר של חלקיקים המגיעים לזרבובית בתדרים מרובים שלמים של תדר יצירת הטיפה, המכילים מספר מבוקר של תאים בכל טיפה. לקבלת תוצאות מייצגות, חלקיקי פוליסטירן של 9.9 מיקרומטר משמשים כתחליפים לתאים. מחקר זה מראה יעילות אנקפסולציה של חלקיק יחיד P_k=1 של 83.7% ויעילות אנקפסולציה של חלקיקים כפולים P_k=2 של 79.5% בהשוואה ליעילות פואסון של 39.3% ו-33.3%, בהתאמה. ההשפעה של ריכוז עקבי של תאים וחלקיקים הוכחה כבעלת חשיבות רבה לאנקפסולציה יעילה, ומטופלים גם מעברי טפטוף לסילון.

מבוא

מתלי תאים מימיים של מדיה רציפה חולקים סביבת נוזל משותפת המאפשרת לתאים לקיים אינטראקציה במקביל וגם הומוגניזציה של ההשפעות של תאים ספציפיים במדידות מהתקשורת. אנקפסולציה בתפוקה גבוהה של תאים לטיפות בקנה מידה פיקוליטר מגבילה את הדגימות כדי להגן על טיפות מפני זיהום צולב, לאפשר מדידה של גיוון תאי בתוך דגימות, למנוע דילול של ריאגנטים וסמנים ביולוגיים מבוטאים, ולהגביר אותות ממוצרי ביו-ריאקטור. טיפות מספקות גם את היכולת למזג מחדש טיפות לדגימות מימיות גדולות יותר או עם טיפות אחרות למחקרי איתות בין-תאיים. ^1,2 ההפחתה בדילול מרמזת על אותות זיהוי חזקים יותר למדידות דיוק גבוהות יותר, כמו גם על היכולת להפחית נפחי דגימה וריאגנטים שעלולים להיות יקרים. ³ אנקפסולציה של תאים בטיפות שימשה לשיפור זיהוי ביטוי החלבון,4 נוגדנים,5,6 אנזימים,7 ופעילות מטבולית⁸ לבדיקת תפוקה גבוהה, ויכולה לשמש לשיפור ציטומטריה בתפוקה גבוהה. ⁹ מחקרים נוספים מציגים יישומים בביו-אלקטרו-ריסוס של טיפות המכילות תאים לספקטרומטריית מסה¹⁰ וציפויים ממוקדים של תאי שטח. ¹¹ עם זאת, יישומים מסוימים הוגבלו בשל היעדר היכולת לשלוט במספר התאים העטופים בטיפות. כאן אנו מציגים שיטה של אנקפסולציה מסודרת¹² המגדילה את יעילות האנקפסולציה המוכחת עבור תא אחד ושניים וניתן להפיק אקסטרפולציה עבור אנקפסולציה של מספר גדול יותר של תאים.

כדי להשיג יצירת טיפות מונו-דיספרס, "מיקוד זרימה" מיקרופלואידית מאפשר יצירת טיפות בגודל נשלט של נוזל אחד (תערובת תאים מימית) בתוך נוזל אחר (פאזה רציפה של שמן) על ידי שימוש בזרבובית שבה הזרמים מתכנסים. ¹³ עבור גיאומטריית זרבובית נתונה, ניתן לשנות את תדר יצירת הטיפות f וגודל הטיפה על ידי התאמת קצבי הזרימה של שמן ומימיים Q_{ו-Q aq}. ככל שקצב הזרימה גדל, הזרימות עשויות לעבור מיצירת טיפות לסילון לא יציב של נוזל מימי מהזרבובית. ¹⁴

כאשר התמיסה המימית מכילה חלקיקים תלויים, החלקיקים נעטפים ומבודדים זה מזה בזרבובית. עבור יצירת טיפות באמצעות תרחיף תאים מימי המפוזר באופן אקראי, החלק הממוצע של טיפות D_k המכילות k תאים מוכתב על ידי סטטיסטיקת פואסון, כאשר D_k = λ^k exp(-λ)/(k!) ו-λ הוא מספר התאים הממוצע לטיפה. חלק התאים שמגיעים לטיפות העטופות "כהלכה" מחושב באמצעות P_k = (k x D_k)/Σ(k' x D_k'). ההבדל העדין בין שני המדדים הוא ש-D_k מתייחס לניצול הנוזל המימי ולכמות מיון הטיפות שיש להשלים לאחר האנקפסולציה, ו-P_k מתייחס לניצול דגימת התא. כדוגמה, אפשר להשתמש בתרחיף תאים מדולל (λ נמוך) כדי לעטוף טיפות שבהן רוב הטיפות המכילות תאים יכילו תא אחד בלבד. בעוד שמדד היעילות P_k יהיה גבוה, רוב הטיפות יהיו ריקות (D_k נמוך), ובכך ידרוש מנגנון מיון להסרת טיפות ריקות, וגם יפחית את התפוקה. ¹⁵

שילוב של יצירת טיפות עם סדר אינרציאלי מספק את היכולת לעטוף טיפות עם מספר צפוי יותר של תאים לטיפה ותפוקות גבוהות יותר מאשר אנקפסולציה אקראית. מיקוד אינרציאלי התגלה לראשונה על ידי סגרה וסילברברג¹⁶ ומתייחס לנטייה של חלקיקים בגודל סופי לנדוד למצבי שיווי משקל רוחבי בזרימת הערוץ. סדר אינרציאלי מתייחס לנטייה של החלקיקים והתאים להתארגן באופן פסיבי לרכבות מהירות קבועות במרווחים שווים. גם המיקוד וגם הסדר דורשים קצבי זרימה גבוהים מספיק (מספר ריינולדס גבוה) וגדלי חלקיקים (מספר חלקיקים ריינולדס גבוה). ^17,18 כאן, מספר ריינולדס Re = uD_h/ν ומספר ריינולדס של החלקיק Rep = Re(a/D_h)², כאשר u היא מהירות זרימה אופיינית, D_h [=2wh/(w+h)] הוא הקוטר ההידראולי, ν הוא הצמיגות הקינמטית, a הוא קוטר החלקיקים, w הוא רוחב הערוץ, ו-h הוא גובה הערוץ. מבחינה אמפירית, האורך הנדרש להשגת רכבות מסודרות במלואן פוחת ככל ש-Re_{ו-Re p} עולים. שימו לב שהדרישות הגבוהות של Re ו-Re_p (למחקר זה בסדר גודל של 5 ו-0.5, בהתאמה) עשויות להתנגש עם הצורך לשמור על קצבי זרימה מימיים נמוכים כדי למנוע סילון בזרבובית ייצור הטיפה. בנוסף, קצבי זרימה גבוהים מובילים למתחי גזירה גבוהים יותר על התאים, שאינם מטופלים בפרוטוקול זה. מחקר האנקפסולציה הקודם שהוזמן הראה כי למעלה מ-90% מתאי HL60 עטופים בודדים בתנאי זרימה דומים לאלה במחקר זה שמרו על שלמות קרום התא. ¹² עם זאת, יהיה צורך לשקול בזהירות את ההשפעה של סולמות הגודל והזמן של מתחי גזירה בעת אקסטרפולציה לסוגי תאים ופרמטרים שונים של זרימה. החפיפה של אילוצי קצב הזרימה המימית של סדר התאים, יצירת הטיפות וכדאיות התא מספקת משטר תפעולי אידיאלי לאנקפסולציה מבוקרת של תאים בודדים ומרובים.

מכיוון שמעט מאוד מחקרים עוסקים בריווח רכבות בין ^{חלקיקים,19,20} קביעת המרווח נעשית בצורה האמפירית ביותר ותהיה תלויה בגיאומטריית הערוץ, קצב הזרימה, גודל החלקיקים וריכוז החלקיקים. עם זאת, המרווח הרוחבי השווה בין הרכבות מרמז על כך שהתאים מגיעים למרווחי זמן צפויים ועקביים. כאשר יצירת טיפות מתרחשת באותו קצב שבו תאים מסודרים מגיעים לזרבובית, התאים נעטפים בתוך הטיפה בצורה מבוקרת. טכניקה זו שימשה לעטיפת תאים בודדים עם תפוקה בסדר גודל של 15 קילו-הרץ,12 שיפור משמעותי לעומת מחקרים קודמים שדיווחו על שיעורי אנקפסולציה בסדר גודל של 60-160 הרץ.4,15 בעבודת האנקפסולציה המבוקרת, למעלה מ-80% מהטיפות הכילו תא אחד ויחיד, שיפור משמעותי ביעילות לעומת סטטיסטיקת פואסון (אקראית). מה שמנבא פחות מ-40% יעילות בממוצע. ¹²

בעבודת אנקפסולציה מבוקרת ^{קודמת,12} המספר הממוצע של חלקיקים לטיפה λ כוון לספק אנקפסולציה של תא בודד. אנו משערים שבאמצעות כוונון קצבי הזרימה, אנו יכולים לעטוף ביעילות כל מספר תאים לטיפה כאשר λ שווה או קרוב למספר התאים הרצוי לטיפה. בעוד שאנקפסולציה של תא בודד היא בעלת ערך בקביעת תגובות תאים בודדים מגירויים, אנקפסולציה מרובת תאים מספקת מידע הנוגע לאינטראקציה של מספרים וסוגי תאים מבוקרים. כאן אנו מציגים פרוטוקול, תוצאות מייצגות באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן, ודיון לאנקפסולציה מבוקרת של תאים מרובים באמצעות ערוץ סדר אינרציאלי פסיבי וזרבובית ליצירת טיפות.

Protocol

הפרוטוקולים בסעיף זה מתארים את החומרים והציוד מנוצל במיוחד על מנת לקבל את תוצאות הניסויים שהוצגו. שימו לב ספקים חלופיים כימיקלים וציוד עשוי להיות מנוצל.

1. המכשיר ייצור ליתוגרפיה Soft

תקן טכניקות ליתוגרפיה רך, ²¹ במספר אשר הוצגו במאמרים קודמים יופיטר, ²² שימשו ליצירת polydimethylsiloxane (PDMS) רשתות מלוכדות microchannel מצעים זכוכית. מלבד ייצור העתק עובש על ידי אמן photolithography SU-8, התהליכים ניתן לבצע מחוץ לחדר נקי או מכסה המנוע נקי, עם זאת, אבק וחלקיקים עדיין צריך להיות ממוזער כדי להשיג תוצאות עקביות.

1. עיצוב דפוס ערוץ מיקרו כפי שמוצג באיור 1 ב-AutoCAD (Autodesk Inc). מעסיקים יצרנית צד שלישי (Fineline הדמיה בע"מ) להדפיס ברזולוציה גבוהה (50,000 dpi) טרנסparency המסכה על הסרט מיילר או קוורץ שבו ערוצי שקופים על רקע כהה.
2. צור סיליקון SU-8 עבור דפוס מאסטר photoresist העתק. בקיצור, ספין SU-8 2050 (MicroChem) photoresist שלילית עם סל"ד מומלץ של היצרן על coater ספין כדי ליצור שכבה עבה על 52 מיקרומטר כמה 7.5 ס"מ נקיים או 10 פרוסות סיליקון ס"מ. לאחר לאפות רך, EDGE הסרת חרוז, חשיפה UV דרך מסכה של איש קשר, שלאחר החשיפה לאפות, פיתוח, וחשיפה המבול, למדוד את עובי שכבת בפועל של 8-SU באמצעות profilometer Dektak (Veeco). סרט עובש אמן על החלק התחתון של התבשיל 4 "או 5" פטרי להתכונן דפוס העתק PDMS.
3. מערבבים PDMS בסיס אלסטומר עם סוכן אלסטומר ריפוי (Dow Corning) ב 10:01 בסיס יחס W / ל לסוכן ריפוי. יוצקים גם מעורב מבשר PDMS על המאסטר סיליקון כדי ליצור שכבה 2-3 מ"מ עובי הסופי. תערובת של בסיס 20 גרם אלסטומר עם סוכן גרם 2 ריפוי מספיק כדי לכסות 4 "פני קוטר.
4. מניחים את master עובש PDMS ב תא ייבוש ואקום (Jencons) לדה גז PDMS דפוקה. באמצעות ווסת לחץ (קול בן הזוג), לאט לאט להפחית את מד תא לחץ של 0 "כספית ל -27" כספית מעל 20 דקות, כדי למנוע עודף קצף. השאירו המכשיר בתא ואקום ב -27 "כספית במשך 30 דקות או עד בועות אוויר להיעלם.
5. לשחרר ואקום ולעבור עובש אב PDMS ל 65 מעלות צלזיוס בתנור (Thermo Scientific) לתקופה של ארבע שעות. המכשיר ניתן להשאיר בתנור למשך הלילה כדי לשפר ריפוי.
6. הסר את ההתקן מהתנור להתקרר. חותכים בזהירות סביב PDMS רקיק עגול בעזרת סכין דיוק לקלף את PDMS. לחתוך את קווי המתאר מכשיר כפי שמוצג באיור 1 עם אזמל.
7. פונץ fluidic יציאות (3 לכל מכשיר) בשלוש אזורים עגולים שמוצג באיור 1 באמצעות אגרוף ביופסיה. עבור התקן זה, השתמש 0.75 מ"מ קוטר חיצוני אגרוף (האריס).
8. לדבוק נייר דבק לצד בדוגמת של PDMS וקליפת להסיר כלאבק. כחלופה עלות חיסכון, אך מעשית מנגנוני פלזמה קונבנציונאלי חמצן, ^21,22 פלזמה לטפל בצד בדוגמת של PDMS ו 3 נקי "x 1" מיקרוסקופ שקופיות הזכוכית באמצעות יד שנערך במעבדה קורונה treater (אלקטרו טכני מוצרים בע"מ .). ²³ שים לב, כי למכשיר יש להשתמש במנדף או מאוורר היטב בשטח עקב הפרשות האוזון, וכל שעונים וטלפונים סלולריים יש לשמור לפחות עשרה מטרים. התאמת הפרשות קורונה להשיג קורונה יציב עם מינימלי מעוררת. לאט לאט לנופף האלקטרודה על 1/4 "מעל פני השטח כל אחד במשך כ 20 שניות ואז מיד להחזיר את המשטחים שטופלו במגע ליצור קשר קבוע וחזק לפני משטחי PDMS לחזור למצב הטבעי שלהם.
9. מניחים את המכשיר על צלחת מתכת, ומכניסים לתנור קר, להגדיר את התנור ל 120 מעלות, ואופים במשך הלילה כדי להשלים מליטה לחזור PDMS למצב הידרופובי המקורי. ²⁴ במהלך האפייה זה חום גבוה, לאהוא משטח הזכוכית של הערוץ יהיה גם שניתנו הידרופובי בשל בתצהיר של שכבת הידרופובי דקה על זכוכית. לחלופין, ציפוי הידרופובי כגון Aquapel (PPG Industries) ניתן להזריק לתוך השקעים fluidic באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט המזרק. ¹² בזהירות אך בתקיפות להזריק Aquapel ואחריו טיהור אוויר לתוך השקעים fluidic בלי לשבור את PDMS לכוס בונד . באגרסיביות לחזור על טיהור אוויר בכל יציאות כניסת ו לשקע תוך מוחה את כל Aquapel עודף על מנת למנוע כל פיקדונות שעלולים לסתום את הערוצים על גבי ייבוש.

2. לדוגמא הכנת

1. להכין תרבית תאים בהתאם לנהלים שנקבעו עבור סוג שבחרת התא. עבור מכשיר מסוים נעשה שימוש במחקר זה, 8-15 חלקיקים מיקרומטר או תאים צריך במידה מספקת להורות אנקפסולציה. סוגי תאים קטנים יותר או גדול יותר עשויים לדרוש שינוי הממדים של ערוץ התמקדות להשיג _{עמ 'Re} הולם. עבור ליתוצאות ההפגנה thod המוצג במאמר זה, קלקר 9.9 מיקרומטר microspheres (G1000, Thermo Scientific) מנוצלים כמו המחליפים סלולריים.
2. מכינים את החלקיק מימית או ההשעיה התא באמצעות ערבוב עדין. בעת שימוש תאים או חלקיקי פוליסטירן, שליטה וריכוז חיוני (ראה איור 4) כדי להשיג אנקפסולציה הורה אידיאלי. שימוש בנתונים הקודמים ¹² כמדריך, לחשב את התא הרצוי או ריכוז החלקיקים מבוסס על המרווח הרכבת הורה וגודל מיקרו ערוצים כמו: תא אחד או החלקיקים הצפויים לכל אורך המרווח פעמים רכבת התמקדות חתך באזור הערוץ. אם ריכוז המניות (1% w / w) אינה מספקת, להגביר את הריכוז (כאן 1.5% w / w) על ידי בעדינות צנטריפוגה מדגם המניות, הסרת נוזל supernatant, מחדש השעיית חלקיקים על ידי מערבולת ערבוב, או ערבוב עדין בעת השימוש בתאים. הכן נפח מספיק כדי להסביר את עוצמת אוסף הרצוי במשך זמן ריצה הקשורים FLow כוונון.
3. שני תאים וחלקיקים פוליסטירן יש משקל סגולי גדול מ 1. אמנם לא הפגינו פרוטוקול זה, לטווח הארוך ניסויים שנמשכו בסדר גודל של דקות ארוכות עד שעות, הציפה להתאים את הפתרון על ידי הוספת המומס כגון CaCl ₂ עבור חלקיקים או OptiPrep (Sigma-Aldrich) של תאים.
4. הכן מדגם 10 מ"ל של שלב fluorocarbon רציפה הנפט על ידי ערבוב שמן fluorocarbon FC-40 (3M) ו-PEG PFPE לחסום פעילי שטח קופולימר ²⁵ (2.5% w / w) (RainDance טכנולוגיות) בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לחלופין, שמן מינרלי אור (כימיקלים PTI התהליך) יכול להיות מנוצל עם פעילי שטח 90 ABIL-EM (2.5% w / w) (Evonik גולדשמידט Corporation).

3. ניסויי ההתקנה

1. כוח על מיקרוסקופ אופטי הפוכה (Axio אובזרוור, Zeiss) ואת המצלמה במהירות גבוהה (פנטום V310, Vision Research). להתמקד ולבדוק את הערוצים עבור כפכפים ופסולת באופן ידני על ידי הזזת המכשיר אובאמצעות מיקרוסקופ ממונע הבמה. פסולת כמה קטן יכול להיות דחף החוצה כאשר נוזל זורם. עבור פסולת גדולה או כפכפים ברורות, בחר ערוץ אחר במכשיר כמו פסולת בערוץ התמקדות יכול לפגוע משמעותית באיכות ההזמנה. שים לב, כפכפים לעתים קרובות ניתן להסיר תחת זרם על ידי לחיצה היטב על פני השטח PDMS מעל האזור הפגוע עם פינצטה קהים.
2. חותכים שלושה אורכי צינורות PVC (0.01 "ID/0.03" OD, Tygon) עבור כניסת מימית, כניסת שמן, וכן עודפים אמולסיה. כדי למזער את נפח מת, לחתוך מספיק צינורות להגיע מן משאבות מזרק לשלב את המיקרוסקופ. לחתוך קצוות צינורות בזווית של 45 מעלות כדי להקל על הכניסה לתוך יציאות fluidic.
3. להשתמש בפינצטה ללחוץ להתאים צינור מסתיים לתוך השקעים fluidic אגרוף בשלב 1 ולאחר מכן הקש להכיל שני 30 בוטה, קצה מד חלד מזרק מחטים פלדה (SmallParts) את הקצוות החופשיים של מימית המתאימה ואת כניסת צינורות נפט (אין צורך דבק) . מניחים את צינורות מוצא אל R פסולתeservoir. צינור זה יהיה מאוחר יותר נכנסו למאגר אוסף.
4. העבר את המכשיר צינורות המצורפת לשלב את המיקרוסקופ, ליישר, ולהתמקד זרבובית את המכשיר באמצעות המטרה זמין (20x שימש לצורך ניסוי זה). כוונן עבור K hler תאורה והגדרות מיקרוסקופ אחרים כנדרש הקלטה אופטימלית.
5. מלא את המזרק 1 מ"ל (BD) עם שלב היטב מעורבת מימית ו מזרק 3 מ"ל (BD) עם פתרון הנפט בשלב מוכן בשלב 2. שים לב כי כל מזרקים של כל אמצעי אחסון ניתן להשתמש ויש שנבחרו בקפידה בהתאם לרוץ פעמים הרצויים וצמצום pulsatility כלשהו. הטה 1 המזרק במאונך קפיצי לעבור בועות אוויר לשקע את המזרק. לאט לאט לדכא את הבוכנה עד כדי לדחוף את האוויר עד קצה המזרק. מחזיק את המזרק במאונך, לחבר את המזרקים כדי מחט המזרק בהתאמה המצורפת למכשיר כבר בשלב 3.3. לדכא את הבוכנה של חיל האוויר באמצעות מחט המזרק נפח הנוזל הוא מת עד עמ 'ushed דרך צינורות כמעט למכשיר. מאובטח לעלות את המזרק משאבת מזרק (Nexus 3000, Chemyx) ועוסקים גוש הבוכנה. חזור על קשרים מזרק 2 ו הר משאבת מזרק 2.
6. הפעל את המשאבה בכל מזרק התוכנית באמצעות פרוטוקולים היצרן של המשאבה. הגדר את ספיקות הראשונים ש _שמן = 50 μL / דקה ו-Q _aq = 5 μL / דקה לשלב את השמן בשלב מימית, בהתאמה. התחל את המשאבות.
7. חכו נוזל זה להיכנס למכשיר ולמלא את הערוצים, דוחף את האוויר המת הנותרים. זה עשוי להימשך מספר דקות. אם יש כמות גדולה של אוויר בצינור היניקה, להגדיל באופן זמני את כל קצב הזרימה עד האוויר מסולק. לא להגדיל את ספיקות גבוהות, כך הלחץ גדול להופיע בערוץ, שעלול לכישלון PDMS אל הכוס בונד.
8. באמצעות ספיקות ראשוניים, לצפות את היווצרות טיפות בכל נחיר (תוצאות המוצג כאן: 20x magnification, מסגרת הדולר 21005 תמונות בשניה, חשיפה 3 μs). להפחית את השדה במצלמה מבט אל הנחיר רק כדי למקסם את המסגרת הדולר ולצמצם את דרישות הזיכרון אם אפשר. לכידת וידאו מדגם ולוודא כי קצב הדגימה הוא מספיק כדי למנוע aliasing.
9. כדי למנוע הטיסות הללו (ראה איור 2), להתחיל עם ספיקה נמוכה מימיות. לאט לאט להגביר את קצב זרימת מימית לקיים סדר חלקיקים בערוץ פתרון ארוך מימית כמו עליית קצב הזרימה.
10. אם ריכוז החלקיקים היא נמוכה מכדי לספק רכבות עם מספר קטן יחסית של חלקיקים "נעדר" מדגם לא ציפה בהתאמה, פיזית להטות את משאבת מזרק לכיוון מוצא את המזרק על מנת לספק ליישוב הדרגתית של חלקיקים לכיוון מוצא את המזרק. שיטה זו באה לידי ביטוי בפרוטוקול וידאו. מדי פעם לסובב את המזרק לאורך הציר שלה עשוי גם להפחית התיישבות בלתי רצויה.
11. לאחר סידור הולם מתרחשת, להתאים את קצב זרימת הנפט לכוון את תדר הדורגודל הטיפות. היקף הירידה הממוצע יכול להיות מחושב לפי שער זרימת מימית חלקי התדר ירידה הדור כפי שנמדד על ידי לכידת וידאו. חוזרת לשנות את שתי ספיקות להשיג שיעורי אנקפסולציה הרצויות ואמצעי אחסון ירידה.
12. אנקפסולציה הורה יציב פעם הוא אישר, להעביר את צינור מוצא מן המאגר פסולת אל תוך המאגר אוסף או להאכיל אותו למכשיר אחר לבדיקה שלאחר מכן.
13. קבע את זמן איסוף מבוסס על המספר הרצוי של טיפות ותדירות הדור מחושב.
14. להקליט את החלק היחסי של טיפות המכילות 0, 1, 2, ..., N חלקיקים לכמת את היעילות באמצעות בין אם הדור ירידה בתוצאות וידאו או pipetting מדגם של תחליב נאסף לבדיקה.

4. נציג תוצאות

תוצאות מוצגים בו גם להשיג שליטה יחיד החלקיקים ומבוקר פעמיים החלקיקים אנקפסולציה (איור 3). על ידי חיתוך קצב הזרימה FC-40 שמן 1/2, חד החלקיקים אנקפסולציה הופך שני החלקיקים אנקפסולציה. לעומת זאת, נוכל הגדילו את קצב הזרימה מימית כדי לספק חלקיקים זרבובית מהר יותר, אבל אנחנו גם לא הגדילו את הסיכון המתפרצת של הנחל מימית. היסטוגרמות באיור 3 מציגים את מספר השבר של חלקיקים בכל ירידה של שני המקרים, יחד עם ההשוואות פואסון לסטטיסטיקה. טיפות מדי פעם עם אפס חלקיקים הם בעיקר בשל חלקיקים "חסרים" ב הרכבות שהוזמנו, ואילו במקרים בהם ישנם חלקיקים כמוס יותר מאשר התוצאה הרצויה מן המקומיים ריכוזים גבוהים של חלקיקים וחלקיקים שלעתים נודדים לעבר אחד משני תפקידים התמקדות אנכיים. שים לב, הציפה התאמה כמתואר בסעיף 2 לא נוצל. במקום זאת, משאבת מזרק היה מוטה באופן פיזי כדי לאפשר יישוב של חלקיקים לכיוון מוצא את המזרק, מה שמוביל לריכוז גבוה של חלקיקים בזמן הריצה.

class = "jove_content"> ריצה הניסוי מדגים את הצורך חלקיק נכונה ריכוזי תאים מוצגת באיור 4. ללא הזמנה מלאה, קבוצות מקומיות של הסדר חלקיקים כמוסות, אבל טיפות רבות ללא חלקיקים. ההיסטוגרמה מראה את היעילות אנקפסולציה ירד אנקפסולציה 2 הרצויה החלקיקים.

באיור 1. מכשיר Encapsulation. א) המכשיר כולל עם פתחי הכניסה, לשקע, ואת ערוץ הזמנת רב. גובה המכשיר הוא 52 מיקרומטר ורוחב הערוץ מזמין הוא 27 מיקרומטר. ב) גם מימית וגם פתחי הכניסה הנפט מסננים פסולת גדולות עם פערים בסדר גודל של רוחב הערוץ מזמין עבור תצוגה מוגדלת של כניסת שמן. ג) צפה זרבובית מוגדלת מראה רוחבי שווה של ערוץ 27 מיקרומטר עבור ערוצי מימית, שמן, ואחריו התכווצות זרבובית של 22 מיקרומטר והרחבת הפתאומית לערוץ רחב יותר מיקרומטר 61.שים לב, את מידותיו של המכשיר המוצג כאן אומתו באמצעות profilometer לאחר microfabrication ו שונה במקצת את ממדי נומינליים על המסכה. התמונה האמיתית של הערוץ מזמין ו זרבובית זמינים באינטרנט כמו איור משלימה 1 . קובץ AutoCAD המסכה יש גם כלל באינטרנט כתוספת כתב היד הזה.

איור 2. Hysteresis של נוטף המעבר המתפרצת באמצעות מכשיר רחב יותר (80 מיקרומטר רחב x 22 מיקרומטר גבוהה). א) בקצב FC-40 זרם בלתי פוסק (ש _שמן = 45 μL / min), יצירת ירידה מתמדת מתרחשת kHz 10 באמצעות שיעור מימית זרימת ש _aq = 8 μL / דקה. כמו קצב זרימת מימית הוא גדל לאט עד 10 & MU, L / min, המתפרצת של זרם נוזל מימי מופעל. ב) כאשר קצב זרימת מוחזר μL 8 / דקה הטיסות הללו ממשיך. שים לב, היווצרות ירידה קבועה ניתן הוקמה מחדש על ידי לחיצה קצרה הפסקה משאבת זרימה מימית (להשהות 1 2 אופייני).

איור 3. אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים. היווצרות) Drop עם תא אחד לכל ירידה (Q _שמן = 60 μL / דק ', ש _aq = 9 μL / min) עם שיעור ירידה של הדור kHz 6.1, גודל ירידה ממוצעת של 24.4 PL, וכמה מתא בודד יעילות לכידת D _k = 79.5% ו P _K = 83.7% (λ = 0.95) עבור גודל מדגם של n = 517 טיפות _ד ו n _p = 491 חלקיקים. ב) היווצרות Drop עם שני תאים לכל ירידה מושגת רק על ידי צמצום FC-40 קצב הזרימה _נפט ל -30 ש μ L / min. גדולים יותר (39.8 את PL) נוצרות טיפות בשיעור של 3.8 kHz ביעילות 2 תאים לכידת D _k = 71.5% ו P _K = 79.5% (λ = 1.80) עבור גודל מדגם של n _D = 383 טיפות ו-N _p = 689 חלקיקים. CD) שתי היסטוגרמות להשוות את אנקפסולציה ירידה החלקיקים יעילות D _K של אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים הורה עם Poisson לסטטיסטיקה (אנקפסולציה אקראית). שים לב שעבור המקרים, מרווח בין החלקיקים לכיוון הזרימה היא כ 17-18 מיקרומטר עבור חלקיקים, הורה באופן מלא לסירוגין. קטעי וידאו משלימים מראה גם אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים זמינים באופן מקוון. לחץ כאן כדי להציג סרט תוספת 3 א . לחץ כאן כדי להציג סרט תוספת 3 ב .

התחת = "jove_content">
ריכוז איור 4. מאוד משפיע על יעילות אנקפסולציה.) כמו ירידה הריכוז, סידור מלא אינו מתרחש, ובכך "חורים" של הרכבות לצאת, לצאת כמה טיפות עם פחות מ חלקיקים צפויים. ב) ההיסטוגרמה מראה את יעילות ירידה ( D _k = 55.9%, P _k = 70.9%) אנקפסולציה של שני החלקיקים בשל הערך הנמוך של λ = 1.57 שם יש כמעט אותו מספר חלקיק יחיד טיפות כמו שיש פעמיים החלקיקים טיפות. התוצאה היא דמות _שמן ש = 30 μL / דקה ו-Q _aq = 9 μL / דקה, תנאי הזרימה זהה איור 3 ב. וידאו משלים נציג זמין באינטרנט. לחץ כאן כדי להציג סרט משלימה 4 .

Discussion

למרות תארים גבוהים יחסית של ההזמנה, לא טיפות כל יכיל את מספר נכון של חלקיקים או תאים. יעילות Encapsulation יכול להיות מחושב על פי מספר התאים או חלקיקים שהפכו הגלום טיפות עם תפוסה הרצוי חלקי המספר הכולל שלהם. נתונים אלה גלם ניתן להשיג גם מן האלגוריתם וידאו אוטומטית במהירות גבוהה או הדמיה מדגם של תחליב אסף. הדבר משול לשבר של חלקיקים P _k הגלום ירידה המכיל חלקיקים K ו את החלק היחסי של טיפות D _K שיהיה בה חלקיקים יא. מ איור 3, הן ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
AutoCAD	Autodesk
שקיפות מסכה	Fineline הדמיה בע"מ
SU-8 photoresist	MicroChem	2050
Dektak Profilometer	Veeco
צלחת פטרי	BD פלקון	351058
PDMS סיליקון ערכת אלסטומר	Dow Corning קורפ	Sylgard 184, מספר חומרים (240) 4019862
אבק תא ייבוש	Jencons	250-030
משאבת ואקום	אלקטל טכנולוגיה אבק	2010 C2
אבק הרגולטור	קולמן בן הזוג	EW-00910-10
תנור	Thermo Scientific	לינדברג כחול M, OV800F
ביופסיה, 0.75 מ"מ	האריס	Uni-Core 15072
המעבדה קורונה Treater	אלקטרו טכני מוצרים בע"מ	BD-20AC, מק"ט 12051A
שקופיות הזכוכית	חותם זהב	3010
Aquapel	PPG Industries		אסטרטגיה אלטרנטיבית
פוליסטירן microspheres, 9.9 מיקרומטר	Thermo	G1000
OptiPrep	Sigma-Aldrich	D1556	לא הפגינו
Luer-Lok מזרקים	BD	1 מ"ל: 309628 3 מ"ל: 309585
FC-40 fluorocarbon שמן	3M בע"מ	סיגמא אולדריץ', F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant	RainDance טכנולוגיות
אור שמן מינרלי	PTI כימיקלים בתהליך	08042-47-5	אסטרטגיה אלטרנטיבית
שמן מינרלי פעילי שטח	Evonik גולדשמידט Corporation	ABIL EM 90	אסטרטגיה אלטרנטיבית
Tygon צינורות PVC	SmallParts	TGY-010
30 Luer-Lok מד מחט מזרק, 1/2 "	SmallParts	לא זמיןE-301PL-C
הפוך מיקרוסקופ	Carl Zeiss הדמיה	Axio Observer.Z1
במהירות גבוהה מצלמה	Vision Research	פנטום V310
מזרק משאבות (2)	Chemyx בע"מ	Nexus 3000
שמן סיליקון	Dow Corning	200 נוזל, 10 CST	אופציונלי עבור אחסון אמולסיה