ייצור ויישום של רוז בנגל-chitosan סרטים בתיקון רקמות ליזר

סיכום

תפרים בדרך כלל יש צורך בתיקון רקמות במהלך ניתוחים. עם זאת, היישום שלהם יכול להיות בעייתי כמו שהם פולשנית ועלולים לגרום ניזק לרקמות. את שיטות הייצור ויישום של דבק רקמות רומן נמצאים כאן דיווח. סרט דבק זה ליזר מופעל ואינו דורש שימוש בתפרים.

תקציר

מליטת רקמת פוטו (PTB) היא טכניקת sutureless לתיקון רקמות, אשר מושגים על ידי יישום פתרון של הוורד נגל (RB) בין ^1,2 2 רקמות קצוות. אלו מכן הם מוקרנים על ידי קרן ליזר, הנספג באופן סלקטיבי על ידי RB. תגובות פוטו נובעים כביכול Crosslink את סיבי הקולגן ברקמה עם ³ ייצור חום מינימאליים. בדו"ח זה, RB כבר שולב בסרטי chitosan הדקים לפברק דבק רקמות רומן שהוא ליזר פעיל. סרטים דביקים, על בסיס chitosan ומכיל ~ RB 0.1% wt, מיוצרים וקשור למעי עגל ועצבי חולדת tibial ידי ליזר מצב מוצק (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / ² סנטימטר, גודל נקודה ~ 0.5 סנטימטר) . Tensiometer טור אחד, ממשק עם מחשב אישי, משמש כדי לבדוק את הכח המלכד. אגרות חוב RB-chitosan הדבקות בתקיפות למעי עם כוח של 15 ± 6 kPa, (n = 30). חוזק ההידבקות יורד ל 2 ± 2 kPa (n = 30) כאשר הליזר אינו מוחל על הדבק. ההשקה של עצבי tibial ניתן גם סיימה ללא שימוש בתפרים. רומן chitosan דבק כבר מפוברק שאג"ח photochemically לרקמות ואינו דורש תפרים.

פרוטוקול

1. הכנת Chitosan דבק

1. אבקת chitosan היא מסיסה בתמיסת חומצה אצטית; להכנת פתרון מניות של חומצה אצטית (2% v / v), להוסיף חומצה אצטית קרחונים 10 מ"ל למי deionized מ"ל 490 (DI-H ₂ O).
2. להכנת פתרון מניות של רוז בנגל (RB) (0.01% w / v) בחומצה אצטית, שוקל 5 מ"ג של RB בבקבוקון עטוף בנייר אלומיניום, כדי למנוע photobleaching. הוסף 0.5 מ"ל של DI-H ₂ O לפזר את האבקה ואז להוסיף 49.5 מ"ל של תמיסת מניות החומצה אצטית (שתואר בסעיף 1.1).
3. להכנת chitosan הפתרון (1.7% w / v), שוקל 0.85 גרם של אבקת chitosan (הבינוני MW, מידת 85% מacetylation) ולהוסיף עד 50 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית RB. השליטה הוכנה על ידי המסת chitosan בתמיסת חומצה אצטית בלי RB.
4. הוסף stirrer מגנטי לתערובת והמערבבים chitosan בטמפרטורת חדר. כדי להבטיח פירוק מלא של הרכיבים, מערבבי chitosanבחומצה אצטית + RB במשך שבועות וchitosan בחומצה אצטית במשך 5 ימים (שליטה). כאשר chitosan נמס, מגבירה את חומציות הפתרון מ~ 2.6 ל ~ 3.9. שים לב שRB הוא גרוע מסיס בחומצי pH והוא דורש עלייה ברמת החומציות של הפתרון וזמן ערבוב ממושך להמסה.
5. צנטריפוגה את הפתרונים ב3270 XG לשעה 1 ולאסוף את supernatant באמצעות, למשל, 10 מיליליטר מזרק סטרילי. הקפד שלא לפגוע בטומאת הגלולה. במהלך שלב זה, פתרון הוא לנקות מזיהומים מאקרוסקופיים וחומר מסיס.
6. הזרק פתרון (centrifuged) chitosan על לוח perpex שטוח באמצעות מזרק סטרילי. העובי של הסרט המיובש תלוי ביחס שבין הסכום של פתרון וחלק את שטח הפנים שעל פתרונו להתפשט. ודא שהפתרון הוא ללא בועות אוויר והתפשט באופן שווה על לוח האבן. כדי להשיג סרטים דקים בעובי ~ 13 מיקרומטר, להזריק ~ פתרון 1 מ"ל מעל ² סנטימטר משטח 12שטח (3x4 סנטימטר ממדים ~, איור 1 א ').
7. כיסוי לוח פרספקס עם מסך, עשוי מרדיד אלומיניום לדוגמה, כדי להימנע מphotobleaching מהפתרון. ודא שאוורור מספיק אוויר מובטח לייבש את הפתרון מתחת למסך.
8. השאר את הפתרון לייבוש בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) ולחץ (אטמוספרות 1) עד הסרט המתקבל הוא מסיס במים ולא להתנפח macroscopically. זו מושגת בדרך כלל ב 2 שבועות.
9. לנתק את הסרטים בעזרת מרית דקה ושטוחה בזהירות: סרטים אלה יכולים להיות קלפו בקלות את לוח פרספקס מבלי לפגוע בם.
10. למדוד את העובי של הסרטים באמצעות מיקרומטר.
11. חותך את הדבק ברצועות מלבניות עם מספריים חדים נקיים ומניח אותם בין שקופיות זכוכית סטריליים כדי לשמור על הצורה השטוחה שלהם. עטוף את השקופיות ברדיד אלומיניום לאור מיגון ולאחסן אותם בטמפרטורת חדר. תייג את הדבקים עם או בלי RB כ" עלה דבק "או" adhes chitosanive "בהתאמה.
12. עלה סרטים דביקים ניתן לעקר באמצעות אתנול (90%) או בקרינת גמא (0.1 KGy / שעה עבור 24 שעות) ^4,5.

2. הנחתה אופטית דבק

1. תקן דבק הוורד בתוך קובט קוורץ.
2. הקלט הספקטרום נחלש בטווח של 400-800 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר הכפול קרן ^4.
3. בהנחת שתוקפו של החוק של באר, לחשב את אורך ההנחתה של הדבק כדלקמן: אני = ₀ אני ^{דואר Ax} איפה אני ₀ היא עוצמת אירוע קורה, 1 / הוא אורך ההנחתה, וx הוא עובי הסרט.
4. חזור על שלבים 2.1-2.3 לchitosan הדבק כדי שישמשו כבקרה.

3 ביישום חוץ גופייה:. Bonding רקמות ליזר במעי

1. מעי עגל קציר מייד לאחר המתת חסד בבעלי החיים וחנות ב-80 ° C.
2. לפני שימוש, להפשיר ומימה tissue ידי טבילתו בDI-H ₂ O למשך 10 דקות.
3. חוצה את הרקמה למקטעים (2 1 סנטימטר) באמצעות # 10 להב תחת מיקרוסקופ (x10). לשמור על הלחות באמצעות סעיפי DI-H ₂ O.
4. הבא את גדמי החתך קרוב זה לזה (סוף הסוף). נגב את עודפי מים מעל פני השטח באמצעות טיפי כותנה.
5. הנח ורדי דבק רצועה (10 6 מ"מ x) על פני החתך בשכבת serosa עם microforceps מבטיח מגע מלא עם המעי (איור 2).
6. הידבקות הרקמות של דבק הוורד מופעלת על ידי קרן ליזר דיודה-שאוב מצב מוצק, המצמיד את הסיבים אופטיים multimode (200 מיקרומטר קוטר הליבה) ^4.
7. הגדר את רמת העצמה של הליזר עד 180 mW ולהקרין את הדבק ל~ 6 דקות עם נקודה בגודל אלומה ~ 5 מ"מ, תוך שימוש בפרמטרים המופיעים בטבלה 1. ספוט להקרין הדבק להבטיח כי כל כתם הוא מוקרן ל~ 5 שניות לפני שעבר את הקרן למקום הסמוך. Tהליכו מבטיח כי קרן הליזר סורקת את פני השטח כולו מספר פעמים הדבקות.
8. כדי להעריך את עוצמתו מליטת הרקמות, להדק מדגם לtensiometer מכויל אחת עמודה (Instron, מסצ'וסטס, ארה"ב) באמצעות ידיות מכאניות. העבר את האוחז ב22 מ"מ / דקה עד שני גדמי הרקמות ⁴ הנפרדים.
9. הנח דבק ורדים על הרקמה כמתוארת בשלב 3.5. לא להקרין את הדגימה ולמדוד את עוצמת מליטת רקמות כמתוארות בשלב 3.8. דגימה זו משמשת כביקורת.

4 ביישומי Vivo:. השקת עצב הטיביאלי

1. להרדים את עכברוש Wistar עם ₂ תערובת isoflurane / פלט (4% במהלך אינדוקציה, 2% לאחר מכן) ^5. תת עורי להזריק Buprenex (0.03 מ"ג / ק"ג) כדי לספק פעילות המשככת כאבים תוך ניתוח ולהקל על כאב או אי נוחות אפשרי.
2. הניתוח הבא צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ (x10). הפוך עור אלכסוניחתך כ 3 סנטימטר בחלק dorso-הלטרלי של ירך ימין ולחשוף את עצב הטיביאלי עם גישת שריר פיצול דרך שרירי gluteal ^2.
3. חלקית לבתר ולקצץ adventitia של עצב הטיביאלי באמצעות מייקרו מספריים ישרים ולספוג את עודפי מים עם גזה סטרילית או טיפי כותנה.
4. חותך את עצב הטיביאלי עם מייקרו מספרי.
5. מקם chitosan רצועה סטרילית (x 4 מ"מ מידות 5) מתחת לעצב הטיביאלי באמצעות מייקרו מלקחיים.
6. גדמי העצב מקצה לקצה עם מלקחיים הזעירים מעל הרצועה הדביקה הוורד משוער.
7. הרצועה שומרת באופן מלא בעצב להרכיב צווארון, שיכול לסייע ברוטציה של העצב במהלך הקרנת הליזר של הרצועה.
8. הפעל עלה דבק עם הליזר כמתואר בשלבים 3.6) ו -3.7).
9. חתוך את הדבק עלה מיותר מהצווארון של העצב המופעל.
10. סגור את השרירים והעור עם חמישה תפרים 3-0 ^5.
11. נהלי התאוששות לאחר הניתוח סטנדרטיים צריכים להיות אחרי כולל בדיקה יומית לבקיעה או היווצרות מוגלית וממשל משכך כאבים, אם נדרשו.

5. נציג תוצאות

הסרטים שמתקבלים הם בהיר עלו בצבע, רזה ויש לי משטח חלק (איור 1). הם גם גמישים וניתן לגלגלו לתוך צינורות בקוטר קטן ללא דמעות גורמות או כל ניזק אחר נראה לעין (1B איור). דבק הוורדים יש שתי פסגות בקליטת 530 ו562 ננומטר; הליזר הירוק הוא בכך נספג מאוד על ידי הדבק ואורך ההנחתה המקביל ב 532 ננומטר הוא ~ 12 מיקרומטר (איור 3). לעומת זאת, chitosan סרטים ללא RB פוחתים חולשת הליזר (1 / A ~ 162 מיקרומטר), כנראה עקב פיזור. נראה מעלילת הספקטרום שאין הצטברות משמעותית של RB מתרחשת בסרטים.

עלה אג"ח דבק בחוזקהלמעי על הקרנת ליזר (איור 2) השיג עומס אופייני מרבי בכישלון של 0.9 ± 0.4 N (n = 30). דבק הכח הוערך כעומס המרבי מחולק בשטח הדבק, כלומר, 15 ± 6 kPa (n = 30). דבק הוורד אינו המוקרן קשור באופן משמעותי פחות לרקמות (2 ± 2 kPa, n = 30, מבחן t המזווג p <10 ^6). ההשקה ב- vivo של עצב הטיביאלי הושגה בהצלחה בעקבות היישום והמליטה של דבק הוורדים בשיתוף עם הליזר הירוק. שבוע לאחר הניתוח, העצב פעל היה בהמשכיות וכוח התיקון היה 17 ± 9 kPa (n = 10).

איור 1.) פתרון RB-Chitosan הנו casted על פרספקס עובי שטוח לוח (לוח ~ 5 מ"מ). נייר גרף ממוקם מתחת ללוח כדי להקל על הצעד יבש הגבס. F לא המסיסה במיםILM מתקבל שבועות לאחר יציקה. B) דבק הוורד הוא גמיש ויכול להיות מגולגל לגליל קטן.

איור 2. דבק הוורד הוא ערובה למעי עגל לאחר הקרנת ליזר. הקרנה אחידה מוחלת על דבק RB במהלך רקמת מליטה; נקודות נבחרות זאת מוצגות בתמונה הזאת כדי להמחיש את השפעת תמונת הלבנה-של הליזר על הדבק.

איור 3. ספקטרום הבליעה (ביחידות שרירותיות) של דבק הוורד מראה שתי פסגות ב530 ו562 ננומטר. הליזר הירוק (λ = 532 ננומטר) הוא בכך נספג מאוד על ידי הדבק במהלך חשיפת הליזר. Chitosan הדבק בלי RB סופג היטב את קרן הליזר.

	n	שטח (מ"מ 2)	ספק (W)	זמן (ים)	Fluence (J / סנטימטר 2)	אני (W / סנטימטר 2)	טען / איזור מקס (kPa)
דבק + ליזר	30	60 ± 10	0.18 ± 0.03	365 ± 5	~ 110	~ 0.9	15 ± 1
דבקים	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

טבלת 1. מקרא. n, מספר מדגם; שטח, שטח פנים של ורדי הדבק (ממוצע ± שגיאה מרבית); כוח, כוח הליזר (ממוצע ± שגיאה מרבית); זמן, זמן הקרנה (ממוצע ± שגיאה מרבית); Fluence, fluence ליזר הממוצע; אני, IRR המוערךadiance; טען / איזור מקס, עומס מרבי בכישלון של רקמת התיקון מחולקת בשטח הדבק, (ממוצע ± SE).

דיון

עלה ייצור דבק מבוסס על תהליך פשוט יבש גבס, אם כי פירוקה של RB בחומצי pH דורש ערבוב ממושך של פתרון chitosan. חשוב לתת הפתרון מתייבש עד שהוא הופך סרט לא מסיס במים. זה קורה כאשר תכולת מים במשקל היא ~ 10% בסרט המיובש ^6. סרטים בדרך כלל מסיסים מתקבלים 2 שבועות לאחר יבש ליהוק בתנאים סטנדרטיים של טמפרטורה ולחץ (~ 25 ° C ו ~ atm 1). המנגנון של מליטת רקמה לא ברור עדיין, אם כי זה היה ציין כי מתמוסס RB מהדבק לרקמות הסמוכות, המאפשר ליזר לתמונה ולהפעיל אותו ביעילות בממשק שהרקמה. זה י...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
רוז בנגל	סיגמה אולדריץ	632-69-9
Chitosan (הבינוני MW)	סיגמה אולדריץ	10318AJ
חומצה אצטית קרחונית	סיגמה אולדריץ	08050051	2% v / v במי DI
stirrer המגנטי	HEIDOLPH	MR Hei-Mix S
סרכזת	Beckman Coulter	אלגרה X-12R
ספקטרופוטומטר	ריאן	קארי 4000-UV לעין
ליזר	CNI ליזר	MGL-532
מיקרומטר	Mitutoyo	סדרת 227
מיקרוסקופ הניתוחי	Zeiss	OPMI