הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חלקיקים נגיפיים עבור

17K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4352

⸱

16 בנובמבר 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

חלקיקים נגיפיים צמח (VNPs) מבטיחים פלטפורמות ליישומים ביו. כאן, אנו מתארים את ההליכים להתפשטות צמח VNP, טיהור, אפיון, וbioconjugation. לבסוף, אנו מראים את היישום של VNPs לביות והדמית גידול תוך שימוש במודל עכבר xenograft ודימות פלואורסצנטי.

תקציר

השימוש של ננו יש פוטנציאל לחולל מהפכה במדע וברפואת חומרים. נכון לעכשיו, מספר החלקיקים שונים הנחקרים בחשד ליישומים בתחום הדמיה וטיפול. חלקיקים נגיפיים (VNPs) המופקים מצמחים יכולים להיחשב bionanomaterials עצמי התאסף עם גדלים וצורות מוגדרות. וירוסי צמחים נחקרים במעבדת שטיינמץ כוללים חלקיקי icosahedral נוצרו על ידי וירוס Cowpea פסיפס (CPMV) ונגיף פסיפס Brome (BMV), אשר שניהם הם 30 ננומטר בקוטר. אנחנו גם בפיתוח מבני מוט בצורה ופילמנטיות נגזרים מוירוסי הצמחים הבאים: וירוס טבק פסיפס (TMV), המהווה מוטות נוקשות עם ממדים של 300 ננומטר על 18 ננומטר, ותפו"א וירוס X (PVX), שיצירת חלקיקים פילמנטיות 515 ננומטר באורך 13 ננומטר ברוחב (הקורא התייחס לשופטים. 1 ו 2 למידע נוסף על VNPs).

> מנקודת מבטו של מדען חומרים של נוף, VNPs הם אבני בניין אטרקטיביים מכמה סיבות: החלקיקים הם monodisperse, ניתן לייצר בקלות בקנה מידה גדול בPlanta, הם במיוחד יציבים, ולא ביולוגיים. כמו כן, VNPs הם יחידות "לתכנות", אשר יכולה להיות מהונדסת במיוחד באמצעות הנדסה גנטית או בשיטות כימיות bioconjugation 3. מבנה VNPs ידוע רזולוציה אטומית, ושינויים יכולים להתבצע עם דיוק המרחבי ברמה האטומית 4, רמת שליטה שלא ניתן להשיג באמצעות ננו הסינטטי עם נוכחיות טכנולוגיות מדינה-of-the-art.

במאמר זה, אנו מתארים את ההתפשטות של CPMV, PVX, TMV, וBMV בצמחי Nicotiana benthamiana Vigna ungiuculata ו. פרוטוקולי שאיבה וטיהור לכל VNP מקבלים. שיטות לאפיון של מטוהרים וVNPs כותרת-כימית מתוארות. במחקר זה, אנו מתמקדים בפרקתיוג emical של VNPs עם fluorophores (למשל Alexa פלואוריד 647) ופוליאתילן גליקול (PEG). את הצבעים להקל על מעקב וזיהוי של VNPs 5-10, וPEG מפחית חיסוני של החלקיקים חלבוניים תוך שיפור הפרמקוקינטיקה 8,11. אנו מראים גידול ביות של VNPs PEGylated באמצעות מודל גידול xenograft עכבר. שילוב של דימות פלואורסצנטי של הרקמות vivo לשעבר באמצעות מערכת הדמית מאסטרו, כימות קרינה ברקמות הומוגניזציה, ומיקרוסקופיה confocal משמש ללמוד biodistribution. VNPs נמחקים באמצעות מערכת reticuloendothelial (מיל '); גידול ביות מושגת באופן פסיבי באמצעות חדירות המשופרות ושמירת האפקט (EPR) 12. ננוטכנולוגיה VNP היא חזק plug-and-לשחק טכנולוגיה לתמונה ולטפל באתרים של מחלה בגוף חי. בנוסף, אנו מפתחים VNPs לשאת מטעני סמים וmoieties הדמיה הרלוונטי קליני-, כמו גם ligands רקמות ספציפיות ללמקד קולטנים מולקולריים overexpressed בסרטן ומחלות לב וכלי דם.

פרוטוקול

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, וTMV) רבייה

  1. הגדר את תא הצמח המקורה שולט עד 15 שעות ביום (אור 100%, 25 ° C, לחות 65%) ו 9 שעות של הלילה (אור 0%, 22 ° C, לחות 60%).
  2. לחסן צמחים בהתאם ללוחות הזמנים בטבלה 1.
CPMV PVX, TMV, וBMV
יום 0: הצמח 3 cowpea זרעים / סיר. יום 0: צמח ~ 30 זרעי N. benthamiana / סיר. לדשן פעם בשבוע עם דשן 1 כף / מים 5 ליטר.
יום 14: Re-סיר נ benthamiana במפעל 1 / סיר.
יום 10: להדביק עלי עלים ראשוניים עם CPMV (5 μg/50 μl / עלה) על ידי הדבקה מכאנית באמצעות שכבה דקה של carborundum. יום 28: להדביק שלוש עד five עוזב עם PVX, TMV, או BMV (5 μg/50 μl / עלה) על ידי הדבקה מכאנית באמצעות שכבה דקה של carborundum.
עלי הקציר ולאחסן ב-80 ° C.: 20 היום עלי הקציר ולאחסן ב-80 ° C.: יום 42

טבלה 1. ציר זמן לגידול, מדביק, וקצירת עלים.

הערה: ריבוי CPMV רק הוכיח כדוגמה.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, וTMV) טיהור

הערה: כל הפעולות נעשית על קרח או ב 4 ° C.

  1. הומוגני 100 גרמו עלים קפוא בבלנדר רגיל באמצעות 2 כרכים של חיץ קר (ראה טבלה 2). לסנן דרך 2-3 שכבות של אריג.
  2. לPVX, להתאים pH ל -6.5 בעזרת 1 M HCl. הוסף 0.2% (w / v) חומצה אסקורבית ו0.2% (w / v) נתרן sulfiטה.
  3. צנטריפוגה homogenate צמח הגולמי ב 5500 XG במשך 20 דקות. איסוף supernatant.
  4. לBMV, שכבת 25 מ"ל של supernatant מעל 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז 10% (w / v). צנטריפוגה XG ב 9000 במשך 3 כדורי hr וresuspend ב 38.5% פתרון CsCl (W / V). מיקס ידי רעד במשך 5 שעות, ולאחר מכן להמשיך עם צעד 2.12.
  5. חלץ חומר צמחי על ידי הוספת 0.7 כרכים של 1:1 (v / v) כלורופורם :1-butanol. מערבבי תערובת במשך 30-60 דקות.
  6. צנטריפוגה פתרון ב5500 XG במשך 20 דקות. לאסוף את השלב המימי העליון.
  7. הוסף לNaCl 0.2 מ 'ו 8% (w / v) PEG (MW 8000). לTMV, גם להוסיף% 1 (נ / v) טריטון X-100. מערבב לשעות לפחות 1, אז תן לו לשבת שעות לפחות 1.
  8. צנטריפוגה פתרון ב15000 XG במשך 15 דקות. Resuspend גלול ב 10 מ"ל של חיץ. לPVX, מוסיף 0.1% β-mercaptoethanol ואוריאה ל -0.5 מ '
  9. צנטריפוגה XG ב 8000 למשך 30 דקות ולאסוף supernatant.
  10. Ultracentrifuge supernatant ב160.000 XG עבור 3 שעות. Resuspend גלול ב 5 מיליליטר החיץ overnight.
  11. הכן 10-40% שיפוע סוכרוז באמצעות נפחים שווים של 10%, 20%, 30%, ו 40% סוכרוז במאגר (1 הכבד ביותר). אפשר השיפוע לאזן בין לילה בטמפרטורת חדר.
  12. Ultracentrifuge resuspended גלולה מעל שיפוע סוכרוז ב100.000 XG ל2 שעות (24 שעות לBMV).
  13. איסוף להקת פיזור אור ודיאליזה נגד מאגר.
  14. לאפיין את VNPs (להלן) ולאחסן ב 4 ° C. עבור אחסון לטווח ארוך, לאחסן ב-80 ° C.
CPMV וTMV חיץ 0.1 מ 'אשלגן פוספט (pH 7.0)
38.5 mM KH 2 PO 4
61.5 mM K 2 HPO 4
PVX 0.5 מ 'borate החיץ (pH 7.8)
0.5 חומצה בורה M
התאם pH עם NaOH
BMV סמה חיץ (pH 4.5)
25יצטטו נתרן 0 mm
10 mM MgCl 2
2 מ"מ β-mercaptoethanol (להוסיף צח)

טבלת 2. Buffers והמתכונים שלהם לכל VNP.

הערה: ריבוי CPMV רק הוכיח כדוגמה.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, וTMV) אפיון

  1. בצע ספקטרוסקופית UV / גלויה כדי לקבוע את הריכוז של VNPs.
    1. מדוד את הספיגה של 2 μl של מדגם באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.
    2. לקבוע את הריכוז של חלקיקים וצבעים באמצעות חוק באר למברט (= εcl, שם הוא ספיגת ε הוא מקדם ההכחדה, c הוא הריכוז, ואני הוא אורך הדרך). אורך המסלול הוא 0.1 סנטימטר לNanoDrop.
      מקדמי הכחדת VNP הספציפיים הם:
      CPMV: 8.1 סנטימטר -1 מ"ג -1 מ"ל (ב260 ננומטר)
      PVX: 2.97 סנטימטר -1 מ"ג -1 מ"ל (ב260 ננומטר)
      TMV: 3.0 סנטימטר -1 מ"ג -1 מ"ל (ב260 ננומטר)
      BMV: 5.15 סנטימטר -1 מ"ג -1 מ"ל (ב260 ננומטר)
  2. נתח חלקיקים על ידי כרומטוגרפיה גודל הדרה מהר חלבון נוזלי (FPLC).
    1. באמצעות 6 עמודת גודל הדרת Superose ויקטע Explorer, 50-100 מיקרוגרם העומס של VNPs ב200 μl של חיץ 0.1 מ 'אשלגן פוספט (pH 7.0).
    2. הגדרת גלאים עד 260 ננומטר (חומצות גרעין), 280 ננומטר (חלבון), ואורך גל העירור של כל צבעים מצורפים.
    3. לרוץ בקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה במשך 72 דקות.
    4. פרופיל elution וA260: A280 ננומטר מציינים אם הכנת VNP היא טהורה ואם חלקיקים הם שלמים ומורכב.
      A260 הבא: 280 יחסים מצביעים הכנת VNP טהורה:
      CPMV: 1.8 ± 0.1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1.7 ± 0.1
  3. בצע denaturing (הטרומי NuPAGE) 4-12% אלקטרופורזה Bis-טריס polyacrylamide שיפוע ג'ל לנתח טוהר ההכנה והצמיד לחלבוני מעייל בודדים.
    1. הוסף 3 מ"ל של חיץ מדגם LDS 4x עד 10 מיקרוגרם של החלקיקים ב9 μl של חיץ פוספט אשלגן. הוסף μl נוסף 1 של חיץ 4x LDS מדגם ו 3 μl של β-mercaptoethanol לBMV כדי לצמצם את המספר הגבוה של איגרות חוב דיסולפיד.
    2. דגירה בבלוק חום למשך 5 דקות ב 100 ° C.
    3. טען דגימות על ג'ל SDS.
    4. הפעל דגימות ב 200 V עבור 1 שעה ב1x מגבים רצים חיץ.
    5. לתעד את הג'ל תחת אור UV לדמיין חלבוני מעייל ניאון.
    6. לחלבון שאינו ניאון, כתם עם Coomassie כחול (0.25% (w / v) Coomassie בריליאנט בלו R-250, 30% (v / v) מתנול, 10% (v / v) חומצה אצטית) לשעה 1.
    7. Destain עם מתנול 30%, 10% חומצה אצטית בן לילה. צ'אןge הפתרון במידת צורך.
    8. לתעד את הג'ל תחת אור לבן.
  4. נתח את היושרה של חלקיקים על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (TEM).
    1. לדלל דגימות ל0.1-1 מ"ג / מ"ל ​​ב20 μl מי DI.
    2. הנח 20 טיפי μl של דגימות על Parafilm.
    3. כיסוי טיפין עם רשת TEM ותן לו לשבת 2 דקות. פתילה את הפתרון העודף על הרשת עם נייר סינון.
    4. שטוף את הרשת על ידי צבת על טיפת מי DI אז פתילה יבשה.
    5. כתם רשת על ידי צבת על ירידה של 20 μl של 2% (w / v) תצטט uranyl עבור 2 דקות. פתילה את עודפי כתם עם נייר סינון.
    6. שטוף את הרשת פעם נוספת במים.
    7. ציית לרשת מתחת למיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

4. נטייה כימית של VNPs עם PEG וfluorophores, טיהור, ואפיון

  1. לחישובים לתגובות למטה, במבנה השן של VNPs הם:
    CPMV: 5.6x 10 6 ג'/ mol
    PVX: 35 x 10 6 ג'/ mol
    TMV: 41 x 10 6 ג'/ mol
    BMV: 4.6 x 10 6 ג'/ mol
  2. צמד צבעים וPEG לlysines פני השטח של CPMV וPVX באמצעות צעד אחד succinimide תגובת N-הידרוקסי צימוד: הוסף 2500 שווים טוחנת (כל ההגזמות הטוחנות מתייחסות לעודף טוחן לVNP) של אסתר Alexa פלואוריד 647 succinimidyl ו4500 שווים של NHS- PEG (MW 5000) מומס DMSO לCPMV בחיץ פוספט אשלגן M 0.1. כאשר עובדים עם PVX, להוסיף עודף 10,000 טוחנות של NHS-צבע וNHS-PEG. התאם את כרכי חיץ וDMSO כאלה שהריכוז הסופי של CPMV וPVX הוא 2 מ"ג / מ"ל ​​ותוכן DMSO הוא 10% מהיקף התגובה הכולל. דגירת תגובת התערובת למשך הלילה בטמפרטורת חדר המוגן מפני אור. CPMV וPVX לנו 300 ו1270 lysines מיעון, בהתאמה. (הקורא התייחס להערות הבאות לקריאה נוספת עלשינוי כימי של CPMV וPVX: 13-15).
  3. צבעים צמודים ופג tyrosines של TMV על ידי צימוד diazonium אחריו נחושת (אני)-הקטליזאטור cycloaddition יזיד-alkyne.
    1. הכן מלח diazonium (alkyne) על ידי ערבוב של 400 μl monohydrate 0.3 מ 'p-toluenesulfonic חומצה, 25 μl של הניטריט נתרן M 3.0, ו 75 μl של 0.68 M מזוקק 3-ethynylaniline מומס באצטוניטריל ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. הוסף 3.3 מ"ל של חיץ borate, 8.8 pH, המכיל 100 mM NaCl ל -1.25 מ"ל של TMV (20 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות).
    3. מגיב TMV עם 450 μl של מלח פתרון diazonium (alkyne) באמבט קרח ל3 שעות להוסיף קשירת alkyne להתמודד לTMV ידי צימוד diazonium. הפתרון יהפוך לצבע חום בהיר. TMV יש 2140 tyrosines זמין עבור הצמיד.
    4. לטהר את המוצר הסופי בעזרת כרית סוכרוז כמתואר בשלב 4.4.
    5. צרף Alexa פלואוריד 647 יזידו תפקודיים וPEG-יזיד (MW 5000) usinנחושת גרם (אני)-הקטליזאטור cycloaddition יזיד-alkyne (CuAAC). מוסיף 2 שווים של צבע וPEG-תזיד לחלבון מעייל ולדגור עם 1 mM CuSO 4, AMG 2 מ"מ, וascorbate 2 מ"מ נתרן בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. התאם את עוצמת החיץ כזה שהריכוז הסופי של תגובת TMV הוא 2 מ"ג / מ"ל. (הקורא התייחס להערות הבאות לקריאה נוספת על שינוי הכימי של TMV: 16,17).
  4. הצמוד צבעים לlysines ופג cysteines של BMV ציסטאין מוטציה (cBMV):
    1. הוסף 2000 שווים טוחנת של גרין אסתר succinimidyl אורגון 488 מומס בDMSO לcBMV ב0.1 מ 'TNKM חיץ (50 mM טריס בסיס, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 המ"מ MgCl 2, 7.4 pH). התאם את כרכי חיץ וDMSO כאלה שהריכוז הסופי של BMV הוא 1 מ"ג / מ"ל ​​ותוכן DMSO הוא 10% מהיקף התגובה הכולל. דגירת תגובת תערובת הלילה ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    2. חלקיקים לטהר באמצעות centriמסנני מנוסה כמתוארת בשלב 4.4.
    3. הוסיפו עודפי טוחנת 2000 של PEG-maleimide (MW 2000) תוך שימוש בתנאי התגובה כמו פעם ודגירת תערובת התגובה ל2 שעות ב 4 ° C. cBMV יש 180 lysines וcysteines תגובתי. (הקורא התייחס להערות הבאות לקריאה נוספת על שינוי הכימי של BMV: 18).
  5. טיהור: להעביר את הפתרון דרך 40% (w / v) כרית סוכרוז ב160.000 XG תמורת 2.5 שעות. מחדש להתמוסס הגלולה במאגר. לחלופין, דיאליזה נגד חיץ המתאים באמצעות 10 מסנני ספין חתוכים KDA.
  6. אפיון: VNPs PEGylated וfluorescently כותרתו מנותחת באמצעות שיטות מתוארות לעיל: ספקטרוסקופיה סגולה / גלויה, ג'ל אלקטרופורזה SDS, FPLC, וTEM (לא מוצג, לעומת זאת, מתייחס לאיורי 6 ו 7).

5. מיקוד גידול והדמיה תוך שימוש במודל עכבר xenograft

  1. תרבות HT-29 תאי סרטן מעי גס אנושיים במדיום RPMI בתוספת 5% FBS, 1% פניצילין סטרפטומיצין, ו 1% L-גלוטמין על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באמצעות 175 2 צלוחיות תרבות תאי סנטימטר.
  2. שטוף תאים פעמים עם סטרילי PBS ובציר ב דוגר עם 5 מ"ל של טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להשבית טריפסין עם 5 מ"ל של מדיום RPMI. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5 דקות. ב 4 ° C וresuspend בRPMI הטרי במדיום 5x10 6 cells/50 μl (לקבוע ספירת תאים מוחלטת באמצעות trypan כחול וhemocytometer). מערבב עם נפח שווה של matrigel לפני ההזרקה (לשמור את כל הפתרונים וריאגנטים סטרילית).
  3. רוכשים הישנים NCR עכברי השישה שבועות נו / נו ולשמור אותם על תזונה ללא אספסת עבור 2 שבועות. [הערה:. כל נהלי בעלי החיים חייבים להיות IACUC אושר] להשרות xenografts הסרטני על ידי הזרקה תת עורית של 5x10 6 cells/100 μl / גידול באגפים (2 גידולים / עכבר) באמצעות מד 18 1/2 סטרילימחט. לפקח על בעלי החיים באופן קבוע. מדוד את גודל הגידול באמצעות מחוגה ולאפשר את הגידולים לגדול להיקף ממוצע של 20 מ"מ 3 (בתוך 12 ימים הקרובים). הקצאת עכברים לשתי קבוצות שונות באופן אקראי: PBS וVNP (= 3 חיות / קבוצה / זמן n נקודה). שימוש במזרק 1 מ"ל 28 מד אינסולין, לנהל על ידי 100 μl וריד וריד זנב הזריקה של PBS סטרילי או ניסוח 10 מ"ג / קילו VNP.

הערה: ניסויי רקמות תרבות ומחקרים עם בעלי חיים לא הפגינו. ידות על הפגנה תהיינה מוגבלות לעיבוד רקמות ורכישת נתונים. להתייחסות במודל xenograft גידול HT-29, הקורא נקרא שופט 19.

שלוש טכניקות משמשות כדי להעריך את גידול ביות של VNPs:

  1. דימות פלואורסצנטי באמצעות מערכת מאסטרו הדמיה: עכברי תקריב בנקודתי זמן שונים (2, 24, ו 72 שעות) באמצעות CO 2גז. לנתח את בעלי החיים והבלו כל האיברים העיקריים (מוח, לב, ריאות, טחול, כליות וכבדות), יחד עם הגידולים על הצלעות, הנח את הרקמות בparafilm, ולנתח עם מכשיר דימות פלואורסצנטי באמצעות עירור צהוב ומסנני פליטה (800 מילישניות חשיפה) כדי לזהות את הנוכחות של אותות ניאון ברקמות (נגזר מA647 תווית מוצמדת לVNPs). שמור את התמונות ולנתח עוצמות ניאון באמצעות ImageJ 1.44o תוכנה (http://imagej.nih.gov/ij). השווה את הדפוס של ספיגה של VNPs בגידולים עם רקמות עיקריות אחרות עם זמן.
  2. לאחר הדמיה, לחתוך כל רקמה במחצית ולהטביע מחצית במתחם אוקטובר לניתוח חתך-cryo וconfocal. לאסוף את החצי השני בCryo-בקבוקונים מראש שקל ולהקפיא באופן מיידי אותם באמצעות נוזל N 2. החנות ב -80 ° C עד מוכן לעיבוד נוסף.
  3. כימות פלואורסצנטי: Reרקמות חוט משקולות. הפשר רקמות קפוא בטמפרטורת חדר ולמקם אותם בצינורות 50 מ"ל פלקון נפרדים המכילים 1 מ"ל של PBS. שימוש homogenizer רקמות כף יד, הומוגני הרקמות במשך 2-3 דקות בPBS לאחר מכן להעביר את homogenate לצינורות microfuge. צנטריפוגה את homogenates עבור 10 דקות ב 13000 XG להסרת רקמה שאינה הומוגני.
  4. 100 μl Pipet של supernatant מהרקמות מכל קבוצה (ניסוחי PBS וVNP / נקודתי זמן) לצלחת 384 UV גם שחורה. הערך את עוצמת קרינה (אורכי גל אקס / Em 600/665) באמצעות קורא צלחת. לנרמל את ערכי הניאון המתקבלים על ידי משקולות רקמות.
  5. אימונוהיסטוכימיה: הכן סעיפי cryo-microtome (10 מיקרומטר) ולאחסן ב -20 ° C. כתם סעיפי רקמות לגרעין תא (DAPI) וסמן תא האנדותל (FITC כותרתו אנטי עכבר CD31 נוגדנים). לבצע ניתוח מיקרוסקופיה confocal כדי למפות את כלי הדם ולוקליזציה תוך tumoral של VNP מתויג-fluorescentlys.

הערה: הליך זה לא הוכיח, נתונים מייצגים מוצגים באיור 8. להתייחסות באימונוהיסטוכימיה ושיטות הצביעה המתוארת, הקורא נקרא שופט 19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח השוואתי של צמיחת צמחים; מערך ניסויי, מחקר של שונות בצבע העלים, שיטת כלורוזיס.
איור 1. צמחים נגועים בנגיפי צמחים. צמחי Vigna unguiculata נגועים ב-CPMV (A). צמחי Nicotiana benthamiana נגועים ב-PVX (B), TMV (C), ו-BMV (D). התמונות צולמו כ-10 ימים לאחר הדבקה באמצעות אינוקולציה מכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק גישה לשינוי הכימי של VNPs והיישומים שלהם להדמית גידול vivo. הדמית חית פלואורסצנטי, פלואורסצנציה כימות, ואימונוהיסטוכימיה הטכניקות שהוצגו כאן הן שימושיות לחקר biodistribution והערכת גידול ביות. טכניקות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי גישה של החלקיקים לגידול באמצעות אפקט EPR. על ידי שילוב של התוצאות משיטות האנליטיות השונות, אנחנו מקבלים גישה חזקה להערכת לוקליזציה וbiodistribution של VNPs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIBIB מענקי R00 EB009105 (לNFS) וP30 EB011317 (לNFS), NIH / NIBIB אימוני מענק T32 EB007509 (לAMW), מקרה Reserve University הבינתחומי הברית השקעות גרנט המערבי (לNFS), ומקרה מקיף במרכז סרטן מענק P30 CA043703 (לNFS). אנו מודים לחוקרי הסטודנטים לתואר הראשונים שטינמץ מעבדתם לידות על תמיכה: נדיה איאת, קווין חן, אינדונזית (סיד) דיי, אליס יאנג, סם אלכסנדר, קרייג ד 'קרוז, סטיבן הרן, לורן רנדולף, בריאן אז, ופול Chariou .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ייצור VNPs
תא צמחים פנימיPercival ScientificE-41L2
.V. unguiculata זרעים (California black-eye no. 5)ברפי51771A
.N. benthamiana זרעיםזרעי N. benthamiana הוענקו כמתנה ממכון Salk. הזרעים מופקים באמצעות תרביית צמחים.
קרבורונדוםפישרC192-500
מצע שתילה Pro-mix BXPremier Horticulture713400
דשן Jack's Professional 20-10-20 Peat-Liteג'יי. ר. פיטרס77860
ציוד
רוטור טיטניום 50.2Beckman337901
רוטור SW 32 TiBeckman369694
אולטרה-צנטריפוגה Optima L-90KBeckman365672
רוטור SLA-3000Thermo Scientific07149
רוטור SS-34Thermo Scientific28020
צנטריפוגה Sorvall RC-6 PlusThermo Scientific46910
בקבוק פוליפרופילןBeckman355607עבור רוטור SLA-3000
בקבוק פוליקרבונטBeckman357002עבור רוטור SS-34
מבחנה שקופה במיוחד (Ultra-Clear)Beckman344058עבור מדרג סוכרוז ורוטור SW 32 Ti
בקבוק פוליקרבונטBeckman355618לצורך שקיעה (pelleting) ורוטור 50.2 Ti
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo ScientificNanoDrop2000c
מערכת ג'ל מוכנה מראש PowerEase 500InvitrogenEI8675EU
עמודת הפרדה על בסיס גודל (size-exclusion) מסוג Superose 6 10/300 GL (נפח 24 מ"ל)GE Healthcare17-5172-01
Äכרומטוגרף KTA Explorer 100GE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12RBeckman392302צנטריפוגה שולחנית
קריוסטטLeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life Sciencesבתוך הגוף (In vivo) מערכת דימות
קורע-רקמותBiospec Products985370-395
קורא מיקרו-פלטותTecanInfinite-200
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM)ZEISSLibra 200FE
מיקרוסקופ קונפוקאלי לסריקת לייזר FluoViewOlympusFV1000
כימיקלים וריאגנטים
3-אתנילאניליןSigma Aldrich498289-5G
פלטה שחורה בעלת 384 בארותBD Biosciences353285
ג'ל NuPAGE SDS מסוג Bis-Tris בריכוז 4-12%InvitrogenNP0321BOX
בופר לדגימות LDS בריכוז 4XInvitrogenNP0008
חומצה אצטיתפישרA385-500
אצטוניטרילSigma Aldrich271004-1L
Alexa Fluor 647 azideInvitrogenA10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20006
מסננים צנטריפוגליים Amicon Ultra-0.5 mlMilliporeUFC501096סף חיתוך של 10 kDa
אמינוגואנידין הידרוכלורידAcros Organics36891-0250
חומצה בוריתפישרA74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250פישרBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
דימתיל סולפוקסידפישרBP231-100
נייר סינוןפישר09-801Kדרגת P5
FITC anti-mouse CD31BioLegend102406
סרום עיזיםInvitrogen16210-064
KClפישרBP366-500
נתרן של חומצה L-אסקורביתAcros Organics35268-0050
מתנולפישרA412P-4
MgCl₂2פישרBP214-500
זכוכית למשטחי מיקרוסקופפישר12-544-3
זכוכית כיסוי למיקרוסקופVWR48366-277
בופר MOPSInvitrogenNP0001
mPEG-malננו-גבישיםPG1-ML-2kמשקל מולקולרי (MW) 2000
mPEG-N3ננו-גבישיםPG1-AZ-5kמשקל מולקולרי 5000
mPEG-NHSננו-גבישיםPG1-SC-5kמשקל מולקולרי 5000
NaClפישרBP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *איזומר 6*InvitrogenO-6149
p-טולואןסולפונית מונוהידראטAcros Organics13902-0050
PermountפישרSP15-100
פוטסיום פוספט דו-בסיסיפישרBP363-1
אשלגני פוספט מונובסיסיפישרBP362-1
סודיום אצטטפישרBP333-500
נתרנית נתרןAcros Organics42435-0050
סודיום סולפיטAmresco0628-500G
סוכרוזפישרS6-500
רשת TEMטד פלהFCF-400Cu
Tris baseפישרBP152-500
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-מרקפטו–אתנולפישרO3446I-100
תרבית רקמות
סרום עגל עובריInvitrogen12483-020
המוציטומטרפישר0267110
תאי HT-29ATCCHTB-38
L-גלוטמיןInvitrogen25030-080
PBSCellgro21-040-CV
פניצילין-סטרפטומייסיןInvitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
בקבוקי תרבית רקמהCorning431080175 ס"מ2
טריפן כחולThermo ScientificSV30084.01
טריפסין, 0.05% (1X) עם EDTA 4Na, נוזלInvitrogen25300-054
מחקרים בבעלי חיים
תזונה למכרסמים עם 18% חלבוןHarlan TekladTeklad Global 2018Sתזונה נטולת לוצרנה
מזרק אינסוליןBD Biosciences329410בגודל 28 (Gauge 28)
איסופלורןבקסטרAHN3637
מטריצת Matrigel, קרומי בסיסBD Biosciences356234
עכברי NCR nu/nuבית הספר של CWRU
המתקן המרכזי לבעלי חיים אתמיים וקסנוגרפטים של הפקולטה לרפואה
מזרק סטריליBD Biosciences305196במנף 18 1/2
תרכובת Tissue-Tek CRYO-OCTAndwin Scientific4583

מקורות

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CPMVPEGylation
חלקיקים נגיפיים עבור
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.