מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

סיכום

אורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שוחים החופשיים ג elegans, לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. אנו מדווחים על גישה חדשנית המספקת ניתוח של ג elegans באמצעות דפוסי התאבכות. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית אור ליזר דרך קובט.

תקציר

קרקע ואורגניזמים מיקרוסקופים חיים במים לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. רוב המחקרים של התנהגות אורגניזם מיקרוסקופית, בניגוד לכך, נערכו תוך שימוש בגישות המיקרוסקופ מבוסס, אשר מגבילות את התנועה והתנהגות לשדה צר, כמעט דו ממדי מוקד. ¹ אנו מציגים גישה אנליטית רומן המספקת ניתוח בזמן אמת של חופשיות חי ג elegans בקובט ללא תלות בציוד המיקרוסקופ מבוסס. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית אור ליזר דרך קובט. אנו מודדים את תדרי תנודה לנמטודות חופשיות שחייה.

ניתוח של דפוסי התאבכות השדה רחוק מגלה רמזים על הגל של נמטודות. עקיפה היא התהליך של כיפוף אור מסביב לאובייקט. במקרה זה הוא אור מתפזר על ידי אורגניזמים. גלי האור מפריעים ויכולים ליצור מודעהדפוס iffraction. שדה רחוק, או Fraunhofer, דפוס עקיף נוצר אם מרחק מסך לאובייקט הוא הרבה יותר גדול מאובייקט diffracting. במקרה זה, הדפוס העקיף ניתן לחשב (הדמיית מחשב) באמצעות התמרה פורה. ²

סי אלגנס הן נמטודות קרקע המתגוררת בבני חיות שמנווטות בשלושה ממדים. הם עוברים גם על מטריצה ​​מוצקה כמו אדמה או אגר בדפוס locomotory סינוסי נקרא זחילה ובנוזל בדפוס שונה נקרא שחייה. ³ התפקידים שמלאו מידע חושי המסופק על ידי mechanosensory, chemosensory, ותאי thermosensory ששולטים שינויים פלסטיים בlocomotory דפוסים ומתגים בדפוסים רק מתחילים הובהרו. ⁴ אנו מתארים גישה אופטית למדידת תנועת נמטודות בשלושה ממדים שאינו דורשים מיקרוסקופ וייאפשרו לנו להתחיל לחקור את המורכבות של תנועת נמטודות תחת שיתוף שונהnditions.

פרוטוקול

1. ג הכנה לניתוח elegans וידאו

1. העבר 10-20 נמטודות מבוגרים הרות לצלחות NGM טריות אגר מלאות פטרי באמצעות נקר דק, שטוח פלטינת תיל. את צלחות פטרי מלא באגר NGM מכילות כתם עגול קטן של א ' coli (זן צמיחה מוגבל, OP50, נותן את התוצאות הטובות ביותר) לנמטודות לאכול. לאפשר לנמטודות להטיל ביצים במשך 3-5 שעות ולאחר מכן להסיר את המבוגרים, ובכך לבסס תרבות קטנה, מסונכרנת-התפתחותית של 50-150 נמטודות. לאפשר לנמטודות לגדול לבגרות המוקדמת של צלחות פטרי דוגר על 20 מעלות צלזיוס במשך 4-5 ימים. שיטות התרבות אלה מבוססים על נהלים שנקבעו (Stiernagle 2006). ⁵
2. ביום של ניתוח וידאו, שטוף את צלחת של נמטודות הצעירה המבוגרת עם 1 מיליליטר מי deionized, מזוקקים, ובכך לאסוף 50-150 תולעים מהתרבות המסונכרנת. פתרון חיץ כמו M9 או PBS יכול לשמש גם. השתמש microcentrifuge להסתובב worms לתחתית של תחתית, או לאפשר להם להתיישב על ידי הכח הכביד לכ 15 דקות. הסר את רוב המים מהצינור ולהחליף אותו עם 1 מיליליטר מי deionized, מזוקקים כדי לשטוף את כל חיידקים דבקים מנמטודות.
3. העברת נמטודות במים או חיץ לקוורץ קובט באמצעות micropipette. חשוב לעבוד עם מספר קטן, על נמטודות 5-10 בסך הכל בפעם אחת או אפילו פחות, כך שנמטודות אחד בכל פעם עשויות להיות מואר על ידי הליזר. אם מספר נמטודות על צלחות התרבות הוא גדול מדי, לדלל את התולעים במים או חיץ עד צפיפות רצויה הוא הגיע. כמו כן ניתן לאסוף נמטודות הבודדה לטיפה של מים או בולם בצלחת אגרה טריה לשטוף אותם ולהעביר את התולעים בודדים לקובט. במחקר שלנו, בשימוש 1 מ"מ, 2 מ"מ ו 5 גדלי קובט מ"מ כדי לבחון את ההשפעות של מגבלות פיסיות על חי התנהגות.

2. התקנה אופטית לווידאו Analysiשל

1. בצע התקנה כפי שמוצגת באיור 1 שמשתמשת ב543 ננומטר (ירוק) הליום ניאון (HeNe) בליזר, שתי מראות קדמי משטח אלומיניום, בעל קובט, מסך הקרנה, ומצלמה במהירות גבוהה (Casio Exilim מהירות הגבוהה) המסוגלים בצילום ב~ 240 תמונות בשניות. שתי המראות משמשות לנווט את קרן הליזר באמצעות קובט. גדלים שונים של cuvettes ניתן להשתמש בהתאם לאופי של המחקר. כדוגמה, השתמשתי cuvettes כי הם 5 מ"מ עבה כדי להראות את ההשפעות של אילוצים המרחביים על תדרים שחייה. קרן הליזר חייבת למלא את הדרישות לoversampling;. כלומר, האורגניזם צריך להפריע לא יותר משליש מקרן הליזר. לג elegans, קרן הליזר צריך להיות על 2 מ"מ בקוטר כאשר הוא מקיים אינטראקציה עם נמטודות. קרן הליזר לא צריכה להיות גדולה יותר מ 5 מ"מ בקוטר מאז הדפוס העקיף יהיה קשה לאתר. המרחק בין האורגניזם לdiffracting המסך צריך להיות הרבה יותר גדול מאשרהאורגניזם עצמו.
2. מקום parafilm מעל קובט ולהפוך אותו כדי לערבב את נמטודות בעמודת המים. הנח את קובט בבעל קובט כך שתולעים הם בתחילה בחלק העליון של קובט. שימוש במראות, לכוון את קרן הליזר דרך מרכז קובט. בגלל נמטודות צפופה יותר מים, הם נופלים לאט לתחתית קובט, בעוד באותו הזמן חיו בתוך עמודת המים.
3. על הקרנת המסך, צבע במקום המתאים לקרן הליזר מועבר השחורה כדי לצמצם פיזור כקורה מועבר פוגש מסך הקרנה (איור 2). לחלופין לשים פתיחה במסך הקרנה כדי לאפשר את הקורה מועבר לעבור מסך. ביטול או צמצום פיזור מהקורה מועבר ישמור CCD המערך של מצלמה מלהרוות בשל הקרן המשודרת.
4. כדי ללכוד את מדד לגודל של התבנית העקיפה, לצייר קוכ 5 סנטימטרים ממסך ההקרנה ליד נקודת קרן הליזר המשודר בלי להתערב בתמונת האור מתפזרת.
5. להתחיל להקליט עם המצלמה בעת שהאור בחדר הוא בכך ששורת 5 הסנטימטר היא באותה המד כמו את התמונות העקיפות. כבה את האור בחדר. תמונות שיא התאבכות על המסך עם המצלמה כתולעים עוברים קרן הליזר.

3. הכנת נתוני וידאו

1. התקן תוכנת ניתוח וידאו (וגר Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/) במחשב. יבוא הווידאו לתוך תכנית ניתוח וידאו
2. הגדר את המקור יעלה בקנה אחד עם כתם הליזר המשודר. הגדר את היקף שימוש בקו 5 סנטימטרים על מסך הקרנה.
3. עקוב אחר העקירה הזוויתי של תמונת ההתאבכות נוצרת על ידי כל נמטודות באמצעות תוכנת ניתוח וידאו (איור 3)
4. כדי למצוא את angulaעקירת r על ידי לקיחת arctan (y / x), להעתיק ולהדביק נתונים לגיליון אלקטרוני (Excel) ולהוסיף 180 מעלות או π לכל הזוויות השליליות לייצר גרף רציף (Figure. 4).

4. רכישת נתוני זמן אמת לתצפית מיידית של תדרים שחייה

1. באמצעות אותה ההגדרה כלניתוח וידאו, הנח photodiode (DET10A מThorLabs) עם שטח קטן (~ מ"מ 1 ²⁾ מחוץ למרכז בתבנית העקיפה ממש מול מסך הקרנה.
2. חבר photodiode לאוסצילוסקופ הדיגיטלי (PicoScope נעשה על ידי טכנולוגית פיקו) המתחבר למחשב דרך יציאת USB. לבחון את הדפוסים נמרצות על מסך מחשב.
3. שמור ערכות נתונים שנרכשו בפורמט ASCII או טקסט.

5. ניתוח נתונים

1. לייבא את הנתונים שנרכשו באמצעות וידאו או photodiode לתכנית לניתוח נתונים מסוגלים גל הולם באמצעות מזעור צ'י מרובע. התכנית ששמשה כאן היא מוצא (http://www.originlab.com/). Fit עקום סינוסי לקבוע תדירות חבטות (איורים 4 ו 5).
2. ממוצע תדרי שחייה מדגימות שונות וקובעים את השונות. לצורך המחקר, נתונים סטטיסטיים נותחו באמצעות ANOVA-גורם אחד ואחריו במבחן ההשוואות המרובה Bonferroni. P-value של <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.

6. דפוסי התאבכות מודל באמצעות Mathematica כדוגמה

הערה: דפוסי התאבכות יכולים להיות מודל שימוש בכלים חישוביים רבים ושונים. הליך זה יהיה שונה לכלים שונים כגון Matlab חישוביים, Excel, מוצא וכו '

1. יצירת תמונה: קח תמונות של נמטודות בשקופית מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ מסורתי.
2. Binarize תמונה: ייבא "התולעת" דימוי תולעתיn בMathematica ידי גרירת התמונה לתוך Mathematica. המר את התמונה לתמונה בשחור לבן (binarize). זו יכולה להיות מושגת עם הפקודה 'Binarize' בMathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [תולעת]. התמונה לאחר מכן ניתן לראות בתמונה בשחור לבן.
   לחלופין, השתמש בפקודה 'EdgeDetect' כדי ליצור BlackandWhiteImage: EdgeDetect [תולעת, 6.0,0.035], שבו שני מספרים עוקבים לשלוט בגסות של הקצוות שהתקבלו.
3. המרת תמונה למטריצה ​​של אפסים ואחדים: זו יכולה להיות מושגת עם הפקודה 'ImageData' בMathematica: מטריקס = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. ההתמרה מטריקס: השתמש בפקודה 'הפורה' בMathematica להתמרה פורה המטריצה ​​באמצעות FourierParameters המצוין: FTransform = הפורה [מטריקס, FourierParameters -> {0, -2}].
5. מודולוס כיכר של מטריצה ​​כדי לקבל את המטריצה ​​העקיפה ולשפר את ניגוד תמונה: כיכר המוחלטתערך של המטריצה ​​ולהציג התמונה שתתקבל, שהוא הדפוס העקיף המקביל לתמונה המקורית. כמו כן, נעשה שימוש בפונקציה 'התחבר' לקנה מידת החדות של התמונה: ImageContrast = תמונה [התחבר [1 + (שרירי בטן [FTransform]) ^ 2] / 0.5].
6. שינוי גודל תמונה לצפייה קלה: יבול הדפוס העקיף המרכזי ולשנות את הגודל כרצון: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. השווה את דפוסי התאבכות הדמיית המחשב עם דפוסי התאבכות המתקבלים מתולעים בחופשיות שחייה. (איור 6)

תוצאות

כדוגמה, למדו ג elegans ב1 סנטימטר קוורץ קובט רחב, 5 מ"מ ועובי 4 הסנטימטר קובט הגבוה. דגימת תולעת אחת באמצעות ניתוח וידאו, תדר החייה הממוצעת המתקבל מניתוח וידאו בקובט עבה 5 מ"מ הוא כ -2.5 הרץ (איור 4). כמו כן, דגימת תולעת אחת בשיטת רכישת נתונים בזמן האמת, תקבלו תדירות שחייה של כ -2.7 הרץ (איור 5), באמצעות אוסצילוסקופ הדיגיטלי (PicoScope). הליך זה ניתן לחזור לתולעים רבים. מחקר מפורט של תולעי חופשיות חייה חשף תדירות חייה ממוצעת של 2.37 הרץ בקובט 5 מ"מ. ^6, כצפוי, את תדירות שהחייה גבוהה יותר מזה של תולעת זוחלת (~ 0.8 הרץ). ³ השימוש בשיטה עקיפה זו, תדרי שחייה ממוצע של ג elegans, שמוגבל לשקופית מיקרוסקופ, כבר מצא כדי להתאים את הערך שפורסם בעבר של 2 הרץ. ^1,7

ve_content "> הנהלים הבאים 3.) ולאחר מכן 6.) מאפשר לדוגמנות של שחי דפוסי התאבכות בעזרת תמונות תולעת שהושגו עם מיקרוסקופ קונבנציונלי. את דפוסי התאבכות הדגם משמשים כדי לדמות מחזור שחייה של סי אלגנס ( איור 6). מודל מוצלח מורכב מדפוסי חייה רצופים אפשריים פיזי התואמים את תדרי שהחייה. התולעת צריכה להיות באותה הצורה בסוף מחזור חייה כפי שהיה בתחילתו של מעגל לשחות.

איור 1. ירוק HeNe ליזר נעשה שימוש כדי ליצור תבנית עקיפה דינמית באמצעות חי ג elegans. דפוס עקיף זה צולם ב240 תמונות בשניות.

איור 2. DRA כנף נקודה שחורה מגבירה את הספיגה של הקרן המשודרת. רוויה של המצלמה בגלל אור מפוזר מצטמצמת והתבנית העקיפה הופכת לגלויה.

איור 3. צילום מסך של תוכנת ניתוח וידאו (וגר Pro) עם תבנית עקיפת תולעת שהוא במעקב. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4. נתוני וידאו מתאימים למעגל השחייה של נמטודות בקובט 5 מ"מ. נכון העקומה חושפת תדירות חייה של ~ 2.5 הרץ.

"/>
איור 5. נתונים בזמן אמת מתאים למעגל השחייה של נמטודות בקובט 5 מ"מ. נכון העקומה חושפת תדירות חייה של ~ 2.7 הרץ.

איור 6. השורה העליונה מייצג את דפוסי התאבכות בפועל ומותאמת לדפוסי התאבכות המודל בשורה התחתונה. את דפוסי התאבכות הדגם הופקו באמצעות תולעים בשקופית מיקרוסקופ (שורה אמצעית).

דיון

פתחנו גישה חדשנית למדידה בזמן אמת של תנועה והתנהגויות locomotory פשוטות באורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שאינו דורש שימוש במיקרוסקופים. ⁸ גישה המתודולוגית זה גם יכולה להיות מנוצלת ללימוד אורגניזמים מיקרוסקופים רבים כמו הפרוטיסטים. שיטה זו מוגבלת רק על ידי אורך הגל של אור המשמש. האורגניזם לא צריך להיות קטן יותר מאורך הגל של האור. בנוסף לחיסכון והניידות של כל הציוד הדרוש, יתרון מרכזי אחד של גישה זו היא היכולת למדוד התנהגות בזמן אמת ובשלושה ממדים, ללא אילוצים הצרים של מטוסי תמונה תחת המיקרוסקופ. אפשר גם עם טכניקה זו כדי לבחון את ההשפעות של כוח משיכה או תנאים רבים אחרים בהתנהגות שלא ניתן ללמוד באמצעות גישות המיקרוסקופ מבוססים. ⁹ לפיכך, אנו יכולים להגיע להבנה טובה יותר של מיקרואורגניזם הטבעי locomotory Behaviors המשוחרר מגבולות שקופיות מיקרוסקופ טיפין או בתאי microfluidic מיוחדים (הפרק et al, 2008). ¹⁰

חוסר המידע בשלב דפוס עקיף אינו מאפשר שהליפה הישירה של התמונה המקבילה לאובייקט diffracting מאז הדפוס העקיף השדה רחוק הוא פרופורציונלי לריבוע הערך המוחלט של ההתמרה. לכן אנחנו חישוב דפוסי התאבכות מתמונות תולעת, כך שהם יכולים להיות מתאימים עם את דפוסי ההתאבכות של נמטודות חופשיות חייה (איור 6).

שיטה זו הניבה תוצאות עבור באמת שוחה בחופשיות ג elegans ויכול להיות מיושם על כל מין מיקרוסקופי שתמרונים בסביבה שקופה אופטית כמו מים או פתרונות רבים יוניים שונים. מיקרוסקופים קונבנציונליים רק לאפשר לימודים עם עומק מוקד על סדר מיקרומטרים. ¹¹ זאת בשל מוגבלעומק השדה כאשר התמקדות אור:

שם מספר F N יש יחסי גומלין עם המעגל של בלבול (ג) כך שאורך מוקד קצר קשור בג גדול. ^12,13 אמנם השיטה העקיפה הזה היא בהחלט לא תחליף למיקרוסקופיה הקונבנציונלית, הוא מסוגל כדי לספק תוצאות כמותיות במהירות, כך שמינים יכולים אפילו לטפל בזמן אמת בעלות נמוכה. את דפוסי ההתאבכות ניתן לקבל עם כל מצביע ליזר. את דפוסי ההתאבכות ניתן צולם ברזולוציה של זמן מופחתת שימוש במצלמה דיגיטלית רגילה. בזמן שהמשתמש לא יכול להיות מיקרוסקופ או photodiode זמין, חלקים מרכזיים של ניסוי זה כגון מדידת תדרי חבטות והערכת דפוסי התאבכות יכולים להסתיים בעלות הנמוכה ביותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
543 ננומטר HeNe ליזר	Melles Griot	LGX1	כל ליזר בטווח הנראה לעין עם פחות מ 5 mW ניתן להשתמש.
2 מראות אלומיניום משטח קדמיות	Thorlabs	PF10-03-F01
מצלמת Exilim מהירות גבוהה	קאסיו
קוורץ קובט	תאי Starna	21/G/5
LoggerPro (תוכנה)	רניה		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	וולפרם