מנהל אפי של Therapeutics CNS לעכברי Awake

סיכום

שיטת intranasally מנת להחדיר תרופות לעכברים ערים לצורך מיקוד המוח מתוארת. שיטה זו מאפשרת למינון חוזר לאורך תקופות ארוכות באמצעות ממשל אפי של תרופה ללא הרדמה, ומשלוח אף למוח עם חשיפה מינימאלית מערכתית.

תקציר

אפי ממשל הוא שיטה של ​​מתן סוכנים טיפוליים למערכת העצבים המרכזית (CNS). זה אינו פולשני ומאפשר מולקולות גדולות שאינו חוצות את גישת מחסום דם המוח למערכת העצבים המרכזיים. תרופות ממוקדות ישירות למערכת העצבים המרכזיים עם משלוח אפי, הפחתת חשיפה מערכתית ותופעות לוואי מערכתיות ובכך לא רצויות ^1. משלוח מהאף למערכת העצבים המרכזיים מתרחש בתוך דקות לאורך שני המסלולים העצביים הריח וtrigeminal באמצעות מסלול תאי ואינו דורש תרופה להיקשר לכל קולט או תחבורת אקסונלית ^2. משלוח אפי הוא שיטה זכתה לפרסום נרחב, וכיום הוא משמש בניסויים קליניים בבני אדם ^3.

משלוח אפי של תרופות במודלים של בעלי חיים מאפשר הערכה ראשונית של הפצה ויעילות פרמוקוקינטיים. בעכברים, ניתן להחדיר תרופות לבעלי חיים ערים (לא מורדם) על בסיס קבוע באמצעות specialized אחיזה אפי. משלוח ער מועיל משום שהוא מאפשר למינון כרוני לטווח ארוך ללא הרדמה, זה לוקח פחות זמן מאשר עם הרדמה, וניתן ללמוד ונעשה על ידי אנשים רבים, כך שצוותות של טכנאים מספרים גדולים יכולים מינון של עכברים בפרקי זמן קצרים. יעילות של תרופות מנוהלות intranasally בדרך זו לעכברים הודגמה במספר המחקרים כוללים אינסולין במודלים של עכברים סוכרתיים ^4-6 וdeferoxamine מודלי עכבר אלצהיימר. ^7,8

האחיזה אפי לעכברים ניתן ללמוד, אבל זה לא קל ודורשת תרגול, מיומנות, ואחיזה מדויקת בצורה יעילה כדי לספק תרופות למוח ולהימנע מניקוז לריאות וקיבה. עכברים הם מרוסנים בעבודת יד בעורף שונה ביד הלא הדומיננטית בצוואר שהתקיים במקביל לרצפה, ואילו סמים מועברים עם pipettor שימוש ביד הדומיננטית. בדרך כלל לוקח 3-4 שבועות של הסתגלות לטיפול לפני העכבריםניתן לערוך את אחיזה זה ללא תגובת לחץ. הכנו וידאו יופיטר זה לעשות טכניקת מסירה אפי זה לנגיש יותר.

פרוטוקול

1. הסתגלות לטיפול למינון אפי לעכברי Awake

מבוא

עכברים יש התאקלמו לטיפול לתקופה של 2-4 שבועות לפני תחילת המינון אפי. הסתגלות לטיפול היא חשובה, שכן היא מסייעת להבטיח תנוחת גוף נכונה ליעילות מקסימלית של אספקת סמים אפי ערה. בנוסף, עכברים שלא היה מורגלים היטב לתהליך זה יכול להיות תגובת חרדה קשה לאחר מינון. עכברים צריכים להשקיע כ 2-3 ימים על כל אחד מתשעה שלבים לפני שממשיך לשלב הבא, בהתאם לנוחותו של בעל החיים לטיפול. רמת הלחץ של העכבר צריכה לשמש כמדד להתקדמות. משמעות הדבר הוא ניטור התנועות של העכבר, את הכמות / תדירות מתן שתן, צואה, רועד, ולנשוך. אם יש עכבר בתגובה ללחץ גבוהה, להישאר באותו שלב לפני שממשיך הבא עד לתגובה מופחתת. מדגם SCH ההסתגלותedule ניתן לראות בטבלה 1. התאקלמות של העכברים צריכה להתקדם דרך השלבים הבאים של פעם ביום. ביצוע פעולות אלה יותר מפעם אחת ביום, בניסיון להאיץ את ההסתגלות, אינו מומלץ.

1. הנח את העכבר בכף היד, לתקופה של שתיים עד שלוש דקות, לא יותר מרגל אחת מעל לראש הכלוב, כחיות לעתים קרובות לקפוץ במהלך שלב מקדים זה. אם העכבר מנסה לזחול החוצה של היד ואת זרועו של אחד, פשוט להרים את העכבר בבסיס הזנב ולמקם אותו בחזרה ביד אחת.
2. הנח את העכבר בכף היד לשלוש דקות וללטף את החיה בעדינות. חיות מחמד עכבר directionally מהראש ועד הזנב, תוך מתן אפשרות לבעלי החיים לנוע בחופשיות.
3. הנח את העכבר בכף היד לשלוש דקות בזמן שמעסה מאחורי האוזניים (קל צובט יחד את העור בחלק האחורי של הצוואר באמצעות האגודל ואצבע מצביע).
4. החזק / liFT העכבר בעורף שלה למשך 30 שניות, ומאפשר מנוחת העכבר על גבי הכלוב למשך 30 שניות לפני חזרה את האחיזה שוב.
5. החזק את העכבר באמצעות אחיזה אפי, אשר מתוארת בסעיף 2, אבל לא להפוך את החיה (להשלים עד השלב 2.4). להחזיק בעלי החיים כמו זה לתקופה של 30 שניות ולשחרר חזרה לראש הכלוב. חזור פעם שנייה לאחר תקופת מנוחה של דקה אחת.
6. החזק את העכבר עם האחיזה אפי כאמור בסעיף 2, כולל היפוך חיה כל כך צד הגחון שלה פונה כלפי מעלה לכיוון התקרה. ודא שצווארו של בעל החיים הוא מקביל לרצפה. תחזיק עמדה זו במשך 30 שניות. חזור על פעולה זו פעם שנייה, לאחר תקופת מנוחה של דקה אחת. עכברים מסוימים יתנגדו האחיזה אפי יותר מאחרים, במיוחד כאשר משתמשים בו בפעם הראשונה עם היפוך בשלב זה בהסתגלות. אם העכבר משחרר את עצמו מהלפיתה, שם את העכבר לאחור בחלק העליון כלוב ומחדש את האחיזה. חזור מחדש את האחיזה במידת צורך, אבל לפקח על רמת הלחץ של העכבר ולהחזיר אותו לכלוב במידת צורך. גורם נוסף שיכול לשחק תפקיד באובדן האחיזה בנקודה זו בתהליך ההתאקלמות הוא חוסר הניסיון של המטפלים בבעלי החיים עם טכניקת המסירה אפי.
7. החזק את העכבר עם האחיזה אפי, להפוך, לזמן קצר למקם pipettor עם טיפ ריק מעל כל נחיר, ותחזיק בעמדת בעלי החיים למשך 30 שניות. חזור על פעולה זו אחרי תקופת מנוחה של דקה אחת.
8. החזק את העכבר עם האחיזה אפי, להפוך אותו, ולנהל intranasally 6 μl של מי מלח לתוך n האם השמאל וימין כאמור בסעיף 3 (עד שלב 3.7).
9. החזק את העכבר עם האחיזה אפי, היפוכו, ולנהל intranasally 6 μl של מי מלח לתוך n האם השמאל וימין הצבת פעמי החיה לאחור בחלק העליון הכלוב באמצע, כפי שתואר בסעיף 3.

2. גריפ אפי לשתק עכברי Awake

1. הנח את עכבר on ראש הכלוב.
2. עם האגודל ואצבע המורה של היד הדומיננטית שלך, להחזיק את העכבר בזנבו. שימוש באמצע שלך, הטבעת, ואצבעות זרת, קל להצמיד את החלק התחתון של הגוף לחלק העליון הכלוב (איור 1 א). בואו לתפוס את העכבר על גבי המוטות כמו שאתה קל למתוח את העכבר החוצה וכדאי לתפוס את עורפו.
3. שימוש באגודל והאצבע אמצעית ביד הלא הדומיננטית, לצבוט את העכבר בחוזקה בעורפו (עודף עור) מאחורי הצוואר והכתפיים. מושך את העור הרפוי כדי להפוך את אוהל של עור לרוחב הכתפיים (1B איור). קח כמה שיותר עור שאפשר, אבל להיזהר לא למשוך את שריר שזה יגרום אי נוחות לעכבר. נהגתי בזהירות על מנת שלא תחול יותר מדי לחץ לבית החזה או בעמוד השדרה של בעל החיים. לחץ מוגזם או משייכת העור עשוי להוביל לעיכוב של נשימה במקרים מסוימים.
4. עד מהרה את מקום האצבע ביד הלא הדומיננטית שלך על ראשו של העכבר כקרוב לאף ככל האפשר ולמשוך בחזרה על העור (האיור 1C, 1D). במקביל, חלק את האגודל והאצבע אמצעית לכיוון הראש למצב אופטימלי. באופן אידיאלי, העכבר לא צריך להיות מסוגל להזיז את ראשו אנכי או אופקי.
5. תוך שמירה על האחיזה בעורף, הפך את העכבר על גבה. הגב של העכבר צריך להיות בכף היד שלך. בתקיפות לשמור על הזנב של העכבר (בסמוך לבסיס) על כף היד שלך עם שתי האצבעות האחרונות שלך (טבעת וזרת) על מנת לייצב את העכבר, או שאתה יכול לעטוף את האצבעות על פני הגוף התחתון (האיור 1E, 1F).
6. בשלב זה לוודא שהצוואר וסנטרו של העכבר הם שטוחים ומקבילים לרצפה. הסנטר אמור להיות קרוב לזווית 180 מעלות עם הצוואר ככל האפשר כדי לסייע באספקה ​​אפי. שינויים קלים בזווית עלולים לגרום תרופה לסופו באתר הלא הנכון. ודא את העכבר הוא מסוגל לנשום על ידי צפייה בבטן. העכבר should לא תוכל לזוז, אבל צריך להיות נוח ולא בשום כאב. אם אתה רואה את הצוואר וסנטרו של העכבר עושה "וי", אז אתה צריך מחדש את האחיזה.

3. משלוח אפי של תרופות לעכברי Awake

מבוא

באמצעות אחיזה אפי, כל עכבר רסן פעמים והחזיק בצוואר במקביל לרצפה שלהם בזמן נפח של 20-30 μl של נוזל מנוהל. כרך זה הוא בטוח ויעיל לעכברים קטנים גדולים, אנחנו משתמשים בדרך כלל 24 μl, ומתוארים בפרוטוקול זה. השיטה אפי הערה ניתן להשתמש בעכברים בכל גיל, למשל בעכברים ילודים למחקר מדעי המוח התפתחותית. בעכברים ילודים, הכולל נפח קטן (8 μl) וגודל טיפה (μl 1) יש להשתמש כדי להכיל את הנפח הקטן יותר של חלל האף. תרופות מועברות בדרך כלל לשני עכברים בכל פעם, לסירוגין תקופות מנוחה על מנת להפוך את השימוש היעיל ביותר של זמן ולשמור על oלוח זמנים של n. ההגדרה תהיה בהתאם אם אתה מינון עכברי קבוצה שוכנו או עכברים שוכנו בנפרד קצת שונה. עם העכברים שוכנו בנפרד, כדאי למקם את כל החומרים שלך שבבין הכלובים כדי למנוע מעכברים מעבר מעל לראש הכלוב האחר. עם הקבוצה שוכן עכברים, מינון שמכלוב בלבד. זה חשוב שכל עכבר בכלוב קבוצה שוכנה מקבל את אותו טיפול אפי, כפוטנציאל לזיהום צולב של שני טיפולים שונים קיים בשל גירוש סמים באוויר או במגע עם עור. מומלץ מאוד שגיליון מינון יודפס מראש, כדי להזכיר לטכנאים של מטלות טיפול, להקליט הערות של טיפין שלא נענו, לציין בריאות כללית של כל בעלי חיים, וכו '

צעדים

1. הגדר את הכלובים שבם הם צריכים להיות למינון, והקימו תחנת מינון (איור 2).
2. הסר עכבר מכלוב ולשמור על כלוב במינון.
3. להרים את העכבר באמצעות אחיזה אפי תוארה בסעיף 2.
4. שימוש ביד הדומיננטית שלך, טען את pipettor עם 6 μl של סמים או כלי רכב. הנח את קצה pipettor מלא ליד הנחיר השמאלי של העכבר, בדרך כלל בזווית של 45 מעלות (האיור 1G, 1H). אם יש לך פתרון צמיג ייתכן שתצטרך להגדיל את הזווית שלך ל -90 מעלות כי התרופה עשויה להפעיל את הצד של קצה פיפטה במקום לגרום לירידה. אם צמיג מאוד, מנגב את קצה פיפטה עם רקמה לפני גירוש נוזלי עשויים לעזור. לאט להוציא את התרופה בצורת טיפה קטנה כבמחצית מההיקף (3 μl).
5. הטיפה צריכה להיות ממוקמת קרוב מספיק לנחיר של העכבר כך שהעכבר יכול לשאוף טיפה. מייד אחרי העכבר שואף הטיפה הקטנה הזה, להוציא את השארית של התרופה בקצה פיפטה כדי ליצור עוד טיפה קטנה לעכבר לשאוף דרך נחירו על 2-3 שניות מאוחר יותר. הקפד להתבונן בפה. אם יש לישל כל נוזל בפה, הירידה לא להפוך אותו במלואו לתוך האף וזה יש לציין.
6. החזק את העכבר בתפקיד זה במשך 15 שניות. מומלץ מאוד שטיימר לשמש כדי לתקן את אחיזת סעיף 15 זה.
7. חזור על שלבים 3.3-3.6 לנחיר הימני. אם כל טיפין בבוז, שהירידה צריכה להיות מוחלפת וציינה.
8. הנח את העכבר על גב העליון של הכלוב שלו למשך 2 דקות. חזור על התהליך כולו מתחיל 2 דקות. אחרי הלידה בטיפה הראשונה. זה נותן את העכבר 4 טיפין של 6 μl כל בהיקף של 24 μl של פתרון. לוח זמנים לדוגמה עבור מינון עכברים אחד או שניים בו זמנית ניתן לראות בטבלה 2.
9. אחרי העכבר קבל את כל הטיפין, תחזיר את העכבר לכלוב שלו.

4. טכניקות כלליות בעלי חי טיפול לאקלום ומשלוח של תרופות אפי לעכברי Awake

לאחר כל פגישה או הסתגלות מינון אפי, עכברים צריכים להיות לינה טיפול, כגון דגני בוקר או זרעי חמניות קלופות כחיזוק חיובי. פינוקים ניתנים כפרס וכדי להסיח את הדעה מלגרד את אפם, שעלול לגרום ניזק לעצמם. כאשר עובד עם קבוצות עכברים שוכנו, מספיק פינוקים צריכים להיות ירד לכל עכבר. לפני החזרת חיות לכלוביהן להיות בטוח כדי לשחזר קינים למדינות המקוריות שלהם כדי להפחית את הלחץ. כאשר מינון חי קבוצה שוכנו, כפפות חייבות להיות שונות בין המינון של כלובים כדי לא להעביר ריח ממושבה למושבת כלוב כלוב, כפי שהם יהפכו לאגרסיביים אחד כלפי שניים.

תוצאות

ישנן מספר דרכים כדי לקבוע את היעילות של מתן תרופה. הראשון הוא intranasally לנהל צבע, כגון הודו או דיו כחול תילן ולדמיין את הצבע לאחר המתת חסד של החיה בתוך אפיתל ההרחה ואחרי המוח מוסר, נכנס מערכת העצבים המרכזיים דרך צלחת cribriform. השני הוא למדוד את התרופה נמסרה גם על ידי שימוש בתג כותרת רדיו או באמצעות זיהוי ELISA של המולקולה ללא תווית. דוגמה טובה להפצת סמים במערכת עצבים מרכזיים לאחר מתן לעכברים ערים ניתן למצוא בנסון et al. 2012 ^7. אנו מצפים נורת חוש הריח ועצב...

דיון

שיטה זו מראה כיצד עכברים ניתן לתת מינונים רגילים של תרופה אפי כדי למקד את המוח ללא שימוש בהרדמה. תרופה אפי יכולה להיות מועברת לקבוצות גדולות של עכברים לפרקי זמן ממושכים עם מינימום מאמץ. קבוצה אחת של עד 20 עכברים ניתן לטפל intranasally על ידי אדם יחיד בפחות משעה אחת. מגוון רחב של מולקולות, הנע בין chelators ברזל הקטן לגורמי גדילה לתאי גזע mesenchymal, הוכח במהירות כדי למקד את מערכת העצבים המרכזיים והראה יעילות במודלים של מכרסמים. מנגנונים מוצעים של מסירה ישירה מהאף למוח כוללים הובל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיפטור P20 המכוון ל-6 μl
טיפים לפיפט להטענת ג'ל
טיימר
מיכל פסולת לטיפים
גיליון מינונים לרשימות
עט
תרופה וחומר נשא
מכל להחזקת מבחנות תרופה
בעלי חיים להמסור להם מנה
כפפות רזרביות
נייר סופג לניגוב שתן
טבלה 3. חומרים נדרשים