כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

Summary

טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.

Abstract

מחלות כליה הקשורות אובדן שתן של מולקולות חיוניות גדולות, כגון אלבומין, כבר מזמן חשבתי להיגרם על ידי שינויים בחדירות המחסום מורכבים מpodocytes, תאי אנדותל כלי דם, וקרום במרתף עובד בהרמוניה. נתונים מהמעבדה שלנו באמצעות מיקרוסקופ 2 הפוטונים intravital חשפו מחסום חדיר יותר גלומרולרי סינון (GFB) מאשר סברו עד כה בתנאים פיסיולוגיים, עם ליפה של אלבומין המסונן המתרחש בקבוצת משנה מוקדמת של תאים הנקרא תאי אבובית הפרוקסימלית (PTC) ^{1,2, 3.}

טכניקות קודמות שימש ללמוד סינון הכלייתי והקמה אופיינית למחסום הסינון המעורב micropuncture של לומן של המגזרים צינורי המוקדמים אלה עם דגימה של התוכן וניתוח ⁴ נוזל. מחקרים אלה קבעו ריכוז אלבומין בנוזל luminal להיות כמעט לא קיים; מקביל באופן הדוקלמה שבדרך כלל הוא זוהה בשתן. עם זאת, אפיון של הפולימרים dextran עם גדלים שהוגדרו על ידי טכניקה זו חשף אלה של גודל דומה לאלבומין בסרום היו רמות גבוהות יותר בלומן ושתן צינורי; מציע חדירות מוגברת ^5.

מסמך זה הוא תיאור מפורט של הטכניקה המשמשת כדי להמחיש באופן ישיר ולכמת חדירות אלבומין ניאון גלומרולרי in vivo. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אלבומין מסונן על פני מחסום הסינון לתוך החלל של באומן (הקאמרית הראשוני של סינון שתן), וגם מאפשרת כימות של ספיגה חוזרת אלבומין על ידי צינוריות והדמיה של transcytosis ⁶ הבא אלבומין הפרוקסימלי. העדרו של ניאון אלבומין יחד מאוחרת מגזרים צינורי בדרך לשלפוחית ​​השתן מדגיש את היעילות של המסלול אחזור במגזרים אבובית הפרוקסימלי קודם לכן. יתר על כן, כאשר טכניקה זו יושמה כדי לקבוע חדירותשל dextrans בעל גודל דומה לערכי חדירות כמעט זהים אלבומין דווח ^2. תצפיות אלו תומכות ישירות בצורך להרחיב את הפוקוס של מחלות כליות proteinuric רבות לשינויים שנכללו בטיוב תא אבובית הפרוקסימלי.

Protocol

1. נטיה של סרום אלבומין לעכברוש כלוריד Sulfonyl 101 sulfo-Rhodamine (טקסס האדומה)

1. ממיסים 100 מ"ג של עכברוש 6.667 מיליליטר סרום אלבומין (RSA) ב100 מ"מ של סודיום ביקרבונט pH 9.0, ריכוז סופי 15 מ"ג / מ"ל ​​בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי.
2. פתרון מקום בכוס קרח / מים ומגניבים בין 0 עד 4 ° C.
3. הוסף 200 μl של לפוראמיד דימתיל איכות הגבוהה נטול מים (DMF) לבקבוקון 10 מ"ג של כלוריד Sulfonyl האדום טקסס (TRSC); מערבולת על מדיום במשך 15 שניות.

Results

איור 3 מראה דוגמה של תמונה שנלקחה מglomerulus פני השטח של עכברוש Frömter Wistar מינכן ואת הצעדים שננקטו כדי לקבוע את החדירות של ניאון אלבומין. ערך GSC לאלבומין של 0.0111 נגזר לglomerulus נפילת אדם זה בטווח ראה בזן זה של חולדות מינכן Wistar כאשר במצב הפד ^3. היציבות ראתה בתמונות אלה היא בשל תכנון וביצוע של הוראות המתוארות באיורים 1 ו -2 זהירים. כאמור, את המיקום של החתך בשימוש בexteriorizing הכליות הוא הצעד החשוב ביותר בהפקת יציבה ללא תמונ.......

Discussion

הצעדים המודגשים כאן מייצגים את מה שאנחנו מרגישים להיות אלה שמייצרים ערכי חדירות עקביות ומדויקים משום שהם לעקוף את המלכודות הבאות:

1. פיזור: השימוש בfluorophores פולטות אדום מאפשר גבייה יעילה יותר של אור מאז פוטונים באורך גל ארוך יותר הם פחות נוטים להתפזר. או באמצעות fluorophores פולטות ירוק או כחול יציג וריאציה גדולה יותר בGSC בגלל ההשתנות המוגברת בערכי עוצמה מלולאות הנימים והמרחב של באומן

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 מיקרוסקופ קונפוקלי/רב-פוטוני	אולימפוס אמריקה		מסננים לגלאים: כחול 430/100, ירוק 525/50, אדום 605/90
נעול מצב Ti: ספיר מאי טאי ספקטרום לייזר	פיזיקה-פיזיקה		אורכי גל עירור מתכווננים: ~ 750-1150 ננומטר
גלאי פוטו פוספיד גליום ארסניד	Hamamatsu Corp		הערה: תצורות רכובות קדמיות או צדדיות זמינות.
תוכנת עיבוד תמונה Metamorph	דינמיקה		הערה: גרסה 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 גרסת
טיפול במלקחיים	מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי	Cat# 78266-04
מאיו ניתוחי מספריים	מיקרוסקופיה אלקטרונים מדעי	Cat# 72962
CA מספריים מיקרו דגם 1C300	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	Cat# 78180-1C3
קלי מלקחיים המוסטטיים (ישרים)	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	Cat# 72930
שמיכת מעיל מים + כרית חימום	Gaymar		T / Pump PN 11184-000 שמיכה-66N111CC
Repti-Therm מתחת למחמם מיכל	ZooMed		RH-4
טקסס אדום סולפוניל כלוריד	Invitrogen / בדיקות	מולקולריותCat# T-353
סרום עכברוש אלבומין	סיגמא אולדריץ'	חתול# A-6272
אל-מים באיכות גבוהה DMF	סיגמא אולדריץ'	חתול# 270547
סרט חיטוי קו סטראט	פישר סיינטיפיק	חתול# 11-889-1
כלים תחתונים לכיסוי צלחת ווילקו (50 מ"מ/40 מ"מ כיסוי)	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	Cat# 70665-07