בדיקת Microtensile לסביבה מבוקרת של nanocomposites הפולימר מכאני-מסתגל ל לשעבר vivo אפיון

Summary

שיטה נדונה על ידי ה In vivo התנהגות מכאנית של חומרים המגיבים לגירויים היא פיקוח כפונקציה של זמן. דגימות נבדקות לשעבר vivo באמצעות בוחן microtensile עם פקדים סביבתיים כדי לדמות את הסביבה הפיזיולוגית. עבודה זו מקדמת עוד יותר הבנה In vivo התנהגותו של החומר שלנו.

Abstract

microdevices מושתלים צובר תשומת לב משמעותית לכמה יישומים ביו ^1-4. מכשירים כאלה נעשו מתוך מגוון רחב של חומרים, כל אחד מציע יתרונות וחסרונות משלה ^5,6. הבולט ביותר, בשל ממדי מכשיר microscale, נדרש מודולוס גבוה כדי להקל על השתלה לתוך רקמת חיה. לעומת זאת, את הנוקשות של המכשיר צריכה להתאים את הרקמה שמסביב כדי למזער את המתח מושרה ^7-9 מקומי. לכן, אנו פיתחה לאחרונה סוג חדש של חומרים בהשראה ביולוגי כדי לעמוד בדרישות אלה על ידי מגיבים לגירויים סביבתיים עם שינוי בתכונות מכאניות ^10-14. באופן ספציפי, nanocomposite מבוססת (ויניל אצטט) פולי (PVAc-NC) מציגה ירידה בקשיחות בעת חשיפה למים וטמפרטורות גבוהות (למשל טמפרטורת גוף). למרבה הצער, קיימות מספר שיטות לכמת את הקשיחות של חומרי in vivo ^15, וmechבדיקות anical מחוץ לסביבה הפיזיולוגית לעתים קרובות דורשת דגימות גדולות מתאימות להשתלה. יתר על כן, חומרים המגיבים לגירויים עשויים להתאושש הנוקשות הראשונית שלהם לאחר explantation במהירות. לכן, פיתחנו שיטה שבאמצעותה ניתן למדוד את התכונות מכאניות של microsamples המושתל vivo לשעבר, עם תנאים פיסיולוגיים מדומים נשמר באמצעות לחות ובקרת טמפרטורת ^13,16,17.

לצורך כך, בוחן microtensile מותאם אישית תוכנן כדי להכיל דגימות microscale ^13,17 עם נרחב משתנה moduli של יאנג (טווח של 10 עד 5 מגפ"ס GPA). כפי שמעניין אותנו הם ביישום של PVAc-NC כמצע בדיקה עצבי ביולוגי וישימה, כלי מסוגל אפיון מכאני של דוגמאות בmicroscale היה הכרחי. כלי זה הותאם כדי לספק לחות ובקרת טמפרטורה, אשר ממוזערת מדגם ייבוש וקירור ^17. כתוצאה מכך, המכונאימאפייני al של מדגם explanted משקפים במדויק לאלה של המדגם רק לפני explantation.

המטרה הכללית של שיטה זו היא להעריך כמותית במאפייני vivo מכאניים, במיוחד מודולוס הצעיר על חומרים מבוססי פולימר גירויים, מגיב, מכאני-אדפטיבית. המטרה זו מושגת על ידי ההקמה את התנאים הסביבתיים שיצמצמו שינוי בתכונות מכאניות לדוגמה לאחר explantation מבלי לתרום לירידה בקשיחות בלתי תלויה שנובעים מההשתלה הראשונה. דוגמאות לאחר מכן מוכנות להשתלה, טיפול, ובדיקה (איור 1 א). כל דגימה היא מושתלת לתוך קליפת המוח של חולדות, המיוצגת כאן כמוח חולדת explanted, למשך תקופה מוגדרת (איור 1). בשלב זה, מדגם explanted ונטען באופן מיידי לבוחן microtensile, ולאחר מכן נתון לבדיקת מתיחה (איור1 ג). לאחר ניתוח הנתונים מספק תובנה על ההתנהגות מכאנית של חומרים חדשניים אלו בסביבה של קליפת המוח.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

1. הכן סרט PVAc-NC של עובי בטווח של 25-100 מיקרומטר באמצעות ליהוק פתרון וטכניקת דחיסת ^10-12.
2. סרט דבק לפרוסות סיליקון על ידי חימום על פלטה חשמלית לשתי דקות על 70 מעלות צלזיוס (מעל לטמפרטורת מעבר הזכוכית) כדי לקדם את הקשר אינטימי בין הסרט והרקיק. צעד זה מבטיח שהסרט המוכן נשאר שטוח וקבוע לרקיק סי, שהוא הכרחי לתהליכי micromachining מישוריים.
3. תבנית הסרט לגיאומטריות מדגם הבדיקה על ידי לייזר micromachining (VLS 3.50, VersaLASER). הגדר את ₂ הפרמטרים micromachining לייזר ישירים לכתוב CO לשלטון 1.0% (0.5 רוחב), 4.0% מהירות (56 מ"מ / ים), ו-1,000 פעימות ^ב13,16 אינץ'.
4. דגימות דפוס שישמשו לשם קביעת תנאי סביבה ("דוגמאות להגדרות") למבנים בצורת dogbone עם ממדי כרית לרוחב 1.5 x 1.5 מ"מ ^2, ואלומת אור עמום לרוחבensions 300 x 3,000 מיקרומטר ^2, עם עובי ההתאמה של הסרט לאורך (איור 2).
5. דפוס את הדגימות לניסויים vivo לשעבר ("מדגם שתל") לתוך קורות 300 מיקרומטר x 6 מ"מ, בעובי ההתאמה של הסרט.
6. לשחרר בזהירות את הדגימות מהרקיק באמצעות סכין גילוח ופינצטה.
7. לטיפול במדגם, להכין המחזיקים אקריליים בהזמנה אישית במכונה שנועדו לשמש כחלק ממערכת האחיזה בבוחן microtensile. סימוני לייזר חרוטים להראות אמצע של בעל ו1.5 מ"מ מהסוף. מניחים כמות קטנה של דבק מבוסס על ג'ל cyanoacrylate האמצע של בעל אקריליק ולדבוק בקפדנות באורך 1.5 מ"מ של מדגם השתל לבעל וחופף את קו האמצע המסומן (איור 3). כל דגימת שתל דורשת בעל אקריליק אחד. להיות זהיר כדי להבטיח כי ג'ל הדבק נשאר רק לאורכו 1.5 מ"מ של PVAc-NC שדבק ACRבעל ylic. אחרת, ג'ל הדבק יכול להפריע להתנהגות מכאנית של המדגם.
8. הסר את הלחות מכל הדגימות על ידי הצבת אותם בייבוש במשך לפחות 24 שעות.
9. מדוד את האורך, רוחב ומידות עובי של הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.

2. לקבוע תנאים סביבתיים

1. טען מדגם הגדרה יבש לבוחן microtensile (ראה איור 4), הלחיצה ראשונה בין אוחז הנייד, ולאחר מכן בין אוחז הקבוע.
2. הר מברשת אוויר עם מאגר מלא מים לתוך תנוחה קבועה, עם הזרבובית המופנית כלפי מדגם microtensile. חברו את מברשת האוויר למדחס אוויר דרך צינורות פלסטיק. עם זרבובית מברשת האוויר סגורה לחלוטין, הפעל את מדחס האוויר.
3. תתחיל בהליך בדיקת microtensile מחזורי, לסירוגין בין זן מתיחה (מתח חיובי) ומתח הדחיסה (מתח שלילי) לא יחול עלהוא המדגם, שנותר בתוך אזור אלסטי ליניארי של עלילת מתח מתח. לPVAc-NC, המאמץ ליישם מוגבל פחות מ -2%. בבוחן microtensile המותאם אישית המשמש בניסויים אלה, שיעור הזן היה בשליטה בזמן את כוח הדרוש כדי להשיג את המתח שנמדד. לחלופין, הגדרה שונה עשויה להיות כרוכה שליטה כוח ליישם תוך מדידת המתח שנוצר.
4. בהדרגה להגדיל את הזרימה מנחיר מברשת האוויר, ולפקח על המדרון של עלילת מתח מתח כפונקציה של כמות הזרימה ממברשת האוויר. הזרימה המקסימלי שאינו גורמת לירידה (> 10%) משמעותית במודולוס של יאנג על פני תקופה של 60 שניות היא ברמה שתשמש לניסויי vivo לשעבר. בשלב זה, בתנאי הלחות שלא להרטיב מדגם יבש (ובכך לתרום להפחתה במודולוס של יאנג), וגם יהיה למזער מדגם ייבוש לאחר שנחשף לנוזלים ביולוגיים in vivo היה established.
5. למדוד את הטמפרטורה בסמוך למדגם. הגדרה אידיאלית תכלול צמד תרמי עם צג דיגיטלי, ולהתבצע תוך מברשת האוויר פועל. הגדר את עוצמת והמרחק של מקור קרינת החום כזה שטמפרטורת המדגם שנערכה עד 37 מעלות צלזיוס, כך שיתאים לתנאים פיסיולוגיים.

3. השווה בקרת הסביבה לבקרה ללא סביבה

1. דגימות התקנה לטבול במשך לפחות 30 דקות בופר פוספט. לאחר הסכום הזה של זמן, המדגם רווי לחלוטין וצומצם למודולוס של יאנג המינימום שלה בטמפרטורת נתונה.
2. מהירות טעינת דגימה לבוחן microtensile ולהתחיל בדיקות microtensile מחזורית, עם מברשת האוויר, ואילו במדגם מתייבש. זה יקבע כמה מהר מתייבש המדגם תחת תנאים שאינם מבוקרים.
3. טען מדגם התקנת PBS רווי שנייה לבוחן microtensile, ולהתחיל בדיקות microtensile מחזוריתעם מברשת האוויר ב. זה יקבע כמה מהר מתייבש המדגם תחת תנאי סביבה מבוקרים.

4. השתלת בדיקה וexplantation

1. צרף מדגם שתל למהדק micromanipulator ועמדה מאונכת לרקמת קליפת המוח.
2. לפני הכניסה, לשמור על רקמה לחה עם מי מלח במידה מספקת כדי להבטיח אחידות של מכניקה של רקמות.
3. מנמיכים את מדגם הפולימר לתוך קליפת המוח באמצעות פקדי יד micromanipulator. השאר מדגם ברקמת קליפת המוח, עד שזמן שתל היעד, בדרך כלל בין 1 ל 30 דקות. כדי למנוע מהתייבשות רקמות לנקודות זמן על פני 5 דק ', בקלילות טיפת רקמות בכל 5 דקות באמצעות מטלית כותנה ספוגה מי מלח.
4. בעוד החללית היא מושתל בקליפה, להכין בוחן microtensile לטעינת המדגם מושתל כיום על ידי קביעת מוט הכונן למצב של אפס התזוזה של 3.0 מ"מ מתפס המדגם הנייח. כמו כן, להגדיר את פיית מברשת האווירלהגדרת הזרימה ומקור החום קורן לעצמה הראויה לקבוע בשלב 2.4.
5. בסופו של שתל הזמן שצוין, להעלות את החללית מתוך הקליפה באמצעות פקדי יד micromanipulator. באופן מיידי, ובזהירות, הוצא את המדגם ממהדק micromanipulator ולטעון לתוך בוחן microtensile, כפי שתואר בפירוט רב יותר בשלב 5.2.

5. בדיקת Microtensile של דוגמאות שתל

1. כדי לחסוך זמן אחרי explantation, להבטיח כי בוחן microtensile מוכן לחלוטין לקבל את מדגם השתל לפני ההשתלה, כפי שמתואר בשלב 4.4.
2. מייד לאחר explantation, טען את הדגימה בין שני הסטים של מלחציים בודקים microtensile. מאז המדגם הוא רכוב על בעל אקריליק נועד לשמש את החצי העליון של מהדק אחד, למקם את השתל בהרכבת מדגם האחיזה, צד המדגם הנייד למטה. חשוב להבטיח כי המדגם הוא רכוב מתח כזה שהוא ApplIED רק לאורכו של החללית, כדי למנוע החלת מומנט לדגימה במהלך בדיקה. ככזה, המדגם חייב להיות מותקן על מרכזו של כל מהדק, ואת מהדק חייב להיות ברמה בכבוד אחד לשנייה.
3. להתאים את מיקום המדגם כזה שהמרחק בין מלחציים הוא 3.0 מ"מ, והסוף של החללית ממוקמת לתוך המהדק הקבוע. אורך זה 3.0 מ"מ בין מלחציים הוא אורך מד למדגם, וישמש בחישובים מאוחרים יותר כדי לקבוע את הלחץ על המדגם.
4. מייד לאחר הבטחת המדגם בין שני התפסים, ותוך 2 דקות של explantation מהרקמה העצבית, להפעיל את המנוע בכיוון המתיחה כדי להאריך את המדגם בקצב קבוע (10 מיקרומטר / שניים המשמשים כאן), בה בעת מדידה ורישום התארכות של המדגם (באמצעות מחוון עקירה, Mitutoyu 543-561) וכוח משויך (באמצעות תא עומס, טכניקות מתמרים MDB-2.5) נדרש להתאמץ המדגם.
5. חזור על בדיקת microtensile עבור כל דגימה ו / או כל סט של תנאים (כלומר זמן החדרה).

6. ניתוח נתונים

1. להמיר את נתוני התארכות הגלם לזן ההנדסה פנה למדגם השתל על ידי חלוקת המרחק של התארכות באורך הראשוני מד, כפי שמתואר במשוואה 1, שבו ε הוא המאמץ ליישם, t הוא הזמן, D הוא התזוזה שנמדדה על ידי מיקרומטר מחוון, וL ₀ הוא אורך מד הראשוני של המדגם:
   (1)
2. להמיר את נתוני כוח הגלם ללחץ ההנדסה במדגם על ידי חלוקת כוח (בניוטונים), על ידי טרהשטח חתך nsverse, כפי שמתואר במשוואה 2:
   (2)
   שבו σ הוא לחץ על המדגם, F הוא כוח שנמדד על ידי תא העומס (בניוטונים), W ₀ הוא הרוחב הראשוני של המדגם, ולא ₀ הוא העובי הראשוני של המדגם.
3. העלילה המתח (σ [t]) לעומת מתח (ε [t]) עקומה עבור כל דגימה באמצעות תוכנת מחשב, כגון Microsoft Excel.
4. לבודד את חלק אלסטי ליניארי של העלילה ושימוש בתוכנה מבוססת כלים עקומה הולמים כדי למצוא את הקו המתאים ביותר לחלק זה. השיפוע של קו הכושר הטוב ביותר המתאים למודולוס של יאנג של המדגם. החלק המבודד של העלילה צריך לכלול לפחות 10 נקודות מתח מתח, ויש לנקוט מהחלק של העלילה שבו השיפוע הוא הגדול ביותר.
5. לבדיקות מחזוריות, מודולוס של יאנג יצטרך להיקבע לכל מחזור. זה יכול להיות אוטומטי או באופן ידני.
6. לבדיקות המחזוריות, עלילת מודולוס צעיר של של כל מחזור ביחס לזמן. זה מצביע על כמה שינויים שנמדדו מודולוס עם זמן, וזה מעיד על כמה מהר מדגם התקנה הוא הרטבה או ייבוש.
7. לקבלת דוגמיות שתל, כל דגימה ושעה של שתל מתאים למחזור של הבדיקות המחזוריות אחת. מדוד מודולוס הצעירים של שימוש בהליך שתואר לעיל עבור כל דגימת שתל.
8. עלילה מודולוס של יאנג לעומת זמן שתל. בשלב זה, ניתן לבצע השוואות לחקירות המעבדתיים, וכו '

Results

את התכונות מכאניות של כמעט כל החומרים פולימריים, כולל PVAc-NC שלנו, תלויות בחשיפה לתנאים סביבתיים. בעיקר, אלה כוללים את החשיפה לחום ולחות. כאשר חומר הוא פלסטיק שעקב הספיגה של לחות, או עובר מעבר תרמית, הוא מציג ירידה במודולוס של יאנג. בהכנה ללחות והסביבה בטמפרטורה מבוקרת לאפיון המדגם מכאני vivo לשעבר, חשוב לוודא שיש שינוי מינימאלי בתכולת הלחות של המדגם בעת טעינת הדגימה לבוחן microtensile, כמו גם במהלך בדיקה מכאנית. זו מוערכת באמצעות ניסויים מדגם ההתקנה הבקרה על מנת להבטיח ...

Discussion

קידום מערכות מיקרו יו מושתלים (BioMEMS) לאינטראקציה עם מערכות ביולוגיות מניע את הפיתוח של חומרים חדשים בעלי תכונות הפערים מחויטות. חלק מחומרים אלה נועדו להציג את שינוי בתכונות חומר בתגובה לגירוי שנמצא בסביבה הפיזיולוגית. כיתה לאחרונה פיתחה אחד חומרים מגיבה לנוכחות של נוזלים בונד יוצרי מימן (מים לדוגמה) וטמפרטורות גבוהות להפחתת מודולוס יאנג של, מידה של נוקשות חומר, על ידי שלושה סדרי גודל ^10,11,18. יש חומרים פולימריים אלה nanocomposite פולימר מטריקס רך (כלומר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
רקיק סיליקון	רקיק		כיתה מכנית
גיליון אקרילי שחול	מקצועי פלסטיק	SACR 062EF	עובי 0.062 אינץ'
סכין גילוח	מקמאסטר-קאר	3962A3
פינצטה	מקמאסטר-קאר	8384A47	#5 טיפ
סופר דבק ג'ל	לוקטיט	130380
אוויר מברשת	הצמד תעשייתי	BF175TA
מדחס אוויר	Paasche		B002YKN8YO D500
צמד תרמי	אומגה	HH12A
פלטה חמה	Cimarec	SP131325Q
CO2 לייזר כתיבה ישירה	VersaLaser	3.5
Dessicator	Fisher Scientific	08-595
מנורה
		מיקרו-מתיחה	בהתאמה אישית