שיטה פשוטה להקליט פוטנציאלי שדה תאיים במוח הקדמי דג זברת הזחל מתוארת. השיטה מספקת חזקה In vivo לקריאה מתוך התקף כמו פעילות. טכניקה זו יכולה להיות בשימוש עם זחלי דג זברה מהונדסת גנטי נושאים גנים הקשורים לאפילפסיה או התקפים שהומצאו על ידי מתן של תרופות convulsant.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפילפסיה משפיעה על כמעט 3 מיליון בני אדם בארצות הברית ועד 50 מיליון אנשים ברחבי עולם. מוגדר כהתרחשות של התקפי התגרות ספונטניים, אפילפסיה יכולה להיות שנרכשה כתוצאה מפגיעה במוח או מוטציה גנטית. מאמצים להתקפי מודל בבעלי חיים בעיקר נצלו רכשו עלבונות (תרופות convulsant, גירוי או ניזק מוחי) ומניפולציות גנטיות (מציאת antisense, הומולוגי רקומבינציה או transgenesis) במכרסמים. דג זברה הוא מודל למערכת חוליות 1-3 שיכולים לספק חלופה רבה ערך למחקר אפילפסיה מכרסם מבוסס. דג הזברה נמצאים בשימוש נרחב במחקר של חוליות לגנטיקה או פיתוח, להפגין מידה רבה של דמיון גנטי ליונקים ולהביע homologs ל~ 85% ממוטציות אנושיות ידועות בגן בודד אפילפסיה. בשל גודלם הקטן (4-6 מ"מ אורך), זחלי דג זברה יכולים להישמר בנפחי נוזלים נמוכים כמו 100 μl במהלך ההתפתחות המוקדמת וערהyed בצלחות רבות גם. ריאגנטים ניתן להוסיף ישירות לפתרון שבו עוברים מתפתחים, לפשט את מנהל תרופות ומאפשרים מהיר בהקרנת vivo של תרכובות בדיקה 4. oligonucleotides הסינטטי (morpholinos), mutagenesis, אבץ האצבע nuclease וגישות מהונדסות ניתן להשתמש במהירות כדי לייצר מציאת גן או מוטציה בדג זברת 5-7. מאפיינים אלה להרשות מחקרי דג זברת יתרון חסר תקדים סטטיסטי כוח ניתוח על מכרסמים בחקר הפרעות נוירולוגיות כמו אפילפסיה. בגלל "תקן הזהב" למחקר אפילפסיה הוא לנטר ולנתח את ההפרשות החריגות החשמל שמקורן במבנה מרכזי במוח (כלומר, פרכוסים), שיטה יעילה כדי לתעד את פעילות מוח בזחל דג זברה מתוארת כאן. שיטה זו היא עיבוד של טכניקות הקלטה תאיות קונבנציונליות ומאפשרת ניטור יציב לטווח ארוך של פעילות מוחית בזחלי דג זברה ללא פגע. Sהקלטות שפע מוצגות להתקפים חריפים הנגרמים על ידי יישום של תרופות convulsant אמבטיה והתקפים ספונטניים שנרשמו בדגים מהונדסים גנטי.
פרוטוקול
1. ייצור ביצים ואוספות
- דג זברת גידול בעלי כדלקמן נהלים סטנדרטיים שתוארו בעבר 8. בקצרה, דג זברה בוגר מוגדר ברביית טנקים עם חוצצים במקום. כאשר האורות בחדר הגיעו בבוקר שלמחרת, חוצצים יוסרו מרביית טנקים ודגים מותרים כ 20-60 דקות של זמן זיווג באין מפריע.
- ביצים מטנקי הרבייה נאספות במסננת ולשטוף במי ביצה. ביצים ואז מועברות לצלחת פטרי עם מי ביצה. ביצים ופסולות מופרים יוסרו באמצעות פיפטה העברה.
- צלחת פטרי המכילה מקום לביצים שנאספו בחממה (28-32 מעלות צלזיוס). לאחר בקיעה, סביב שני ימים לאחר ההפריה (DPF), להסיר סיסי וכל פסולת אחרת עם פיפטה העברה.
- ביום רצוי לאחר ההפריה (3-8 DPF) להסיר צלחת פטרי המכיל זחלי חופשיות חייה ומקום על שולחן מעבדה בטמפרטורת חדר.
ss = "jove_title"> 2. Microelectrode מושך והכנה
- שימוש חולץ micropipette, מושך 1.2 מ"מ OD ורוסיליקט זכוכית נימי לשתי מחטים וחנות בצלחת פטרי 150 מ"מ או תיבת פיפטה ריקה על ידי נחת מעל רמפות מרק טיפשיות. מחטים יכולות להיות משך מראש. OD שונות זכוכית נימים ניתן להשתמש בהתאם לסוג של המגבר headstage הזמין.
- Backload microelectrode עם פתרון הקלטה תאי (2 M NaCl) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מזרק Nalgene מסנן (4-מ"מ) וMicrofil נימה (מכשירי ורנר Precision) המצורפת. לנער או קש בולוס לעבר קצה המחט עד שיש כמה בועות או לא הנותרים.
3. ריתוק אגר
- הכן את פתרון חדש של אגר 1.2% נמוכים היתוך נקודה במי ביצה. פתרון אגר מקום בסט אמבט מים ב ~ 37 ° C.
- הכן coverslip עם חדר הקלטה ומקום במקפיא (5-10 דקות). חדר ההקלטה צריך matcשעות שהשתמשו באסדת electrophysiology. אנו משתמשים בחדר בפרופיל נמוך פתוח יהלומי אמבטית הדמיה מורנר מכשירים (הדגם RC-26GLP).
- שימוש פסטר או ההעברה פיפטה, מקום דג זברת זחל אחד בטיפה קטנה של מי ביצה בצלחת פטרי צלחת נקיה. לאגל זה, להוסיף טיפה של תמיסה המכילה חומר הרדמה (0.02% tricaine) וסוכן משתק (1 α-bungarotoxin מ"ג / מ"ל).
- פקח על דג זברה לאובדן של תנועה (5 עד 10 דקות).
- הסר את coverslip / חדר הקלטה ממקפיא. הנח קאמרי על הבמה של stereomicroscope. באמצעות פיפטה העברה, לערבב כמה מ"ל של 1.2% ההיתוך agarose נקודה הנמוך עם פתרון טרנספר (עם דגים) לתא coverslip / הקלטת אגל ו.
- באמצעות קצה פיפטה או מחט בוטה בסדר, זחלי עמדה תחת stereomicroscope כך שההיבט הגבי של הדג חשוף למשטח ג'ל agarose. אפשר agarose להקשיח (5-10 דקות), ולאחר מכן באמצעות העברת מרית שטוחה ב אגרתנעל לחדר הקלטה להגדיר על אסדת electrophysiology.
3. הקלטת שדה תאית
- הוסף 2-5 מ"ל של הקלטת מדיה דג זברה לתא ההקלטה. אם שינויי סמים קאמריים צורך, ינקבו עם פתרון הקלטה בקצב של כ 1 מ"ל / דקה. אין חמצון של פתרון ההקלטה הוא הכרחי.
- הכנס microelectrode (כ 1 מיקרומטר קוטר קצה, 2-7 MΩ) לheadstage המגבר רכוב על micromanipulator תלת ממדי. בדקו שmicromanipulator הוא בתנוחה נכונה על מנת לאפשר טווח התנועה וההסתגלות. הבא את קצה microelectrode לתוך מטוס מבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, ובאמצעות התאמה גסה נמוכים יותר לנקודה שמעל ומעט לפני ראש דג הזברה.
- עם המגבר ב"-מהדק נוכחי "מצב אפס אלקטרודה.
- באמצעות התאמה גסה נמוכה קצה האלקטרודה כך שהוא רק נוגע בשלurface של דג הזברה, מעט לפני המוח הקדמי.
- באמצעות צעדי התאמה עדינים לקדם את קצה האלקטרודה עד שמחורר את העור של דג הזברה. אפשר להתיישב ולאחר מכן לקדם את האלקטרודה כמה מיקרונים לתוך המוח קדמי.
- להקליט פעילות חשמלית במצב הנוכחי מהדק באמצעות תוכנת Axoscope. נתונים נרכשים בקצב דגימה של 10 קילוהרץ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דוגמאות לפריקת התקפים דמוי electrographic נרשמה במוח הקדמי של זחלי דג זברה אגר-מוטבעים מוצגות באיור 1. פריקת פרץ גדול משרעת רבת עלייה חדה בדגימות אלה הייתה מעורר על ידי יישום אמבט של תרופת convulsant, pilocarpine mM 40 (ב; 6 DPF) או picrotoxin mM 1 (בנקודת B, 8 DPF). בהקלטות אלה, משותקים ודג הזברה אגר משובץ ברציפות נמצאים במעקב לתקופה של עד 90 דקות. דגים נשארים קיימא בתנאים אלה להקלטה של עד 24 שעות. תרופות נוספות לרחצה ובינונית בדרך כלל המפוזרת לאגר כדי לעורר פע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת ההקלטה התאית מוצגת כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של פעילות המוח. הקלטות אלה הן מקבילות לניטור electroencephalographic (EEG) משמש בדרך כלל כדי להעריך את הנוכחות של פריקה חשמלית חריגה (כלומר, תפיסה) במכרסמים של 11 חולי אפילפסיה ו12. הקלטות תאיות יכולות להיות משולבות עם מניפולציות תרופתיות, כפי שמוצג כאן. אלו סוגים של הקלטות יכולים לשמש גם להערכת פנוטיפים אפילפטיים פוטנציאליים בדג זברה מהונדסת גנטי. דג זברה מוטנטים הם בדרך כלל זמין למוטציות גנטי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
המחבר מבקש להודות לפיטר קסטרו ומתיו Dinday על מאמציהם המוקדמים להקמת דג זברה במעבדה. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק EUREKA (# R01NS079214-01).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| התכה נמוכה agarose | פישר סיינטיפיק | BP1360-100 | לפזר בתקשורת עובר ב1.2% |
| הקלטת מדיה | פישר סיינטיפיק | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 המ"מ NaCl, 2.9 mM KCl, 10 HEPES מ"מ, 1.2 המ"מ MgCl 2, 10 mM דקסטרוז, 2.1 המ"מ CaCl 2 pH לכ 7.3 עם N NaOH 1 |
| Tricaine | מעבדות argent | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 מ"ג / מ"ל |
| צינורות זכוכית נימים | וורנר מכשירים | G120TF-3 | משוך להתנגדות של 2 -7 MΩ |
| מגבר מהדק תיקון | וורנר מכשירים | PC-505B | אנו משתמשים במגבר וורנר במצב מהדק שוטף; רווח נקבע ברמה של 2 mV / Pa ו Bessel המסנן נקבע על 2K. מודלים דומים ניתן להשתמש על פי הוראות היצרן. |
| מסנן / מגבר | סיגנוס טכנולוגיה | FLA-01 | אנו משתמשים בקדם מגבר Cygnus; רווח נקבע על 10-20; תדירות Cut-off להגדיר ב 1-2K; מסנן חריץ ב. מודלים דומים ניתן להשתמש על פי הוראות היצרן. |
| אקסון / D לוח ותוכנת Axoscope | התקנים מולקולריים | אקסון Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | נתונים נאספים בשימוש במצב Axoscope רכישה ללא פער; דגימה ב 10 קילוהרץ. ניתן להשתמש במודלים ותוכניות דומים על פי הוראות היצרן. |
| מי ביצה | מיידי אוקיינוס | 3 גרם מיידי אוקיינוס ים מלח, מ"ל 0.1% כחול 2 תילן במי 10 מ"ל deionized |
מקורות
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690(2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1(1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759(2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592(2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555(2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
