מאמר שיטה

באנגיוגנזה ריאות עכברוש איסכמי

15.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50217

⸱

8 בפברואר 2013

 , 
1Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University

במאמר זה

סיכום

ריאות perfused על ידי שני עורקי סימפונות המערכתיים ועורקי ריאה. ברוב מחל ריאה, היא מערכת כלי הדם המערכתית הקטנה המציגה neovascularization החזק. הפסקה של זרימת דם ריאתי מקדמת אנגיוגנזה סימפונות נמרצות. אנו מספקים פרטים ניתוחיים של גרימת איסכמיה עורק ריאה השמאלית שמקדמת neovascularization סימפונות.

תקציר

ריאות מבוגר perfused על ידי שני עורקי סימפונות המערכתיים והחזרה ורידית כל זורמת בעורקי הריאה. ברוב מחל ריאה, היא מערכת כלי הדם המערכתית הקטנה יותר שמגיבה לצורך זלוף ריאה המשופרת ומראה neovascularization החזק. איסכמיה בכלי דם הריאתיים הנגרמת על ידי חסימת עורק ריאה הוכחה לגרום לאנגיוגנזה עורקים המערכתיות המהירה באדם כמו גם בכמה מודלים של בעלי חיים. למרות ההערכה היסטולוגית של קורס הזמן של תפוצת עורק סימפונות בחולדות שתוארה היטב על ידי 1 Weibel, מנגנונים אחראים לצמיחה מאורגנת זו של כלי דם חדשים אינם ברורים. אנו מספקים פרטים ניתוחיים של גרימת איסכמיה עורק ריאה השמאלית בעכבר שמוביל לneovascularization סימפונות. כימות היקף אנגיוגנזה מציגה אתגר נוסף בשל נוכחותם של שני ערוצי כלי דם בתוך הריאות. שיטותכדי לקבוע אנגיוגנזה הפונקציונלית המבוססת על הזרקת microsphere כותרתו מסופקים.

מבוא

אנגיוגנזה המערכתית בריאות מוכרת היטב. במצבי מחלה כמו אסטמה 2, פיברוזיס ריאתי ביניים 3, 4 סרטן, ותרומבואמבוליזם כרוני ריאות 5, מערכת כלי דם המערכתית ובמקיף את הריאות ומתרבה פולש parenchyma ריאתי. עם זאת, מודלים של בעלי חיים כדי ללמוד הפעלה זה הפרש של מערכתי ולא מחזור הדם הריאתי הם מעטים. אולי המודל לשחזור ביותר של neovascularization המערכתי בריאות של היונקים הבוגרים הוא זו שמתרחשת לאחר גרימת איסכמיה עורק ריאה כרונית. התגובה לחסימת עורק ריאה שמאלית בבני אדם 5-7, 8 כלבים, חזירים 9, 10 כבשים, חזירי ים 11, 1 חולדות, 12, 13, 14 ועכברים היא ההתרבות המהירה של עורק הסימפונות כמו גם עורקים הבינו צלעיים. המנגנונים האחראים לneovasculari המערכתיאספקת המפעלי של הריאות לאחר איסכמיה ריאתי אינן ידועות ולא נחקרה בהרחבה. כמובן הזמן של אנגיוגנזה סימפונות בחולדה לאחר חסימת עורק ריאה שמאלית שתואר היטב בעבודה היסטולוגית של 1 Weibel. הרחבת העבודה בחולדה, המעבדה שלנו התמקדה בשני גורמי הצמיחה החשובים בתהליך זה, כמו גם את התוצאה הפיזיולוגית של neovasculature זה של הריאה. תוצאות מדגימות הכמוקין CXC CINC-3 הוא גבוה מוקדם לאחר איסכמיה וטיפול בחולדות עם נוגדנים לCXCR2, הקולטן לCINC-3, פוחת אנגיוגנזה 13. Vasculature הסימפונות חדשים שהוקם 14 ימים לאחר תחילתה של איסכמיה ריאתית הוצג להיות נורמלי עם חדירות החלבון גדלו באופן משמעותי 15. תפקוד ריאה שמאלי לא היה מראה רגיל ירד היכולת לשדר וירידה בנפח ריאות 15. למרות neovasculature יכול להיות שותףntributed לשמירה על רקמת ריאות במהלך איסכמיה ריאה הכרונית, נראה שלא יהיה נורמלי ועשויים לתרום לירידה מתמשכת בתפקוד הריאתי.

אולי אחד ההיבטים המוזרים ביותר במודל זה מתייחס לפריסה המרחבית של ריבוי כלי דם. למרות שחרורו של גורמי גדילה בתוך parenchyma הריאות עקב איסכמיה, neovasculature מקורו בעורקי סימפונות זרם גדולים יחסית. עורק הסימפונות הרגיל עולה כסניף קטן מאב העורקים ופולש לעץ בדרכי נשימת קארינה. כך המנגנון שבאמצעותו גורמי גדילה לגרום לשלב הראשוני של arteriogenesis לא ברור. אנו מציעים כי החולדה, האנטומיה דומה לבני האדם וסקולרית, מספקת הזדמנות ייחודית לבחון את המנגנונים האחראים לאנגיוגנזה המערכתית במהלך איסכמיה ריאתי. למרות חסימה מלאה של עורק הריאה השמאלי היא תופעה נדירה בבני אדם,כלי דם מוגבר סימפונות נראה להיגרם דומה בחולים כל האתר והגודל של חסימת עורק ריאת 16. לכן, אנו מספקים תיאור מפורט של הגישה כירורגית לקשור את עורק הריאה השמאלי בחולדות ואמצעים לכמת את סדר הגודל של אנגיוגנזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים שבוצעו על חולדות שאושרו על ידי הטיפול באוניברסיטת ג'ונס הופקינס בבעלי החיים ושימוש בועדה ובהתאם להנחיות NIH. במידת ההאפשר, את החיה צריכה להיות בניתוח prepped באזור נפרד מאזור הניתוח כדי למזער את הזיהום של האתר כירורגית.

1. הרדמה / אלחוש

  1. עכברוש פלייס (חולדות ספרג Dawley גברים, 125-150 G; הרלן, אינדיאנפוליס, אינדיאנה) בלשכת גיוס חדור 3% isoflurane.
  2. הנח עכברוש הרדים על לוח הניתוח מחובר לחרטום והנשמה עם הרדמת isoflurane 3%. השתמש בטכניקה סטרילית לכל הנהלים. לעטוף חולדה כדי להבטיח הפעלת שדה סטרילי.

2. צנרור

  1. לשתק איברים במצב שכיבה באמצעות קלטת כירורגית.
  2. הסר עכברוש מחרטום, להאריך לשון עם מלקחיים מרופדים.
  3. השתמש במד intracath 14 עם stilet מתכת קהה כמדריך. הסט מאחור כדיngue, לתוך קנה הנשימה.
  4. הסר stilet מתכת עוזבת intracath פלסטיק לבן בקנה הנשימה. ודא חולדת הנשימה והאוויר זורם דרך הצינור.
  5. החלף חרטום עם מתאם ישיר לקטטר, חבר חולדה להנשמה (90 נשימות / דקות; נפח 8 מ"ל / קילו גאות; מאוורר מכרסמי דגם 683, הרווארד Apparatus, Holliston, מסצ'וסטס).
  6. החל Puralube (אטלר שיין, דבלין, אוהיו) משחת וטרינרית בעיניים.

3. פתיחת בית החזה

  1. צד ימני חולדת מקום למטה, לשתק איברים באמצעות קלטת כירורגית.
  2. שבי אזור בית החזה מצד שמאל.
  3. הסרת פרווה עודפת עם ואקום קטן.
  4. הפוך שדה סטרילי ידי ניגוב למטה עם אלכוהול אחרי swabstick Povidone-יוד (Dynarex תאגיד, Orangebur, ניו יורק). חזור על תהליך זה עוד פעמים (בהיקף כולל של 3 סקראבס).
  5. הפוך חתך רוחבי במספריים סטריליות מבתרים או אזמל סטרילי במרכז השדה.
  6. להקהות לנתח באמצעות lאיירס של רקמת שומן ועד לצלעות (השכבה האחרונה היא קרום דק המכסה צלעות).
  7. ספירת צלעות כדי לקבוע מקום 3 בצלעי.
  8. שימוש במלקחיים סטריליים 45 ° גרפו, לעשות חתך בוטה בין 3 ובצלע ה 4.
  9. הכניסו מפרידי צלעות, ומשוך בעדינות יצירת חלל פתוח עם הדמיה מלאה של ריאות, קלטת מקום בתפרים להשאיר פתוח.

4. קשירת עורק ריאה שמאלית

  1. עם 90 ° מלקחיים גרפו, להעביר ריאה שמאלית אחורי עם יד ימין.
  2. באמצעות דפוס דומון # 5 מלקחיים ישרים, לתפוס עורק ריאה שמאלי ודרכי נשימה עם יד שמאל. עורק ריאה שמאלי שכבה על גבי דרכי נשימה. ודא שמלקחיים הם ישירות בניצב לשולחן. בנוסף, הוא יעיל ביותר כדי להרים את עורק הריאה השמאלי / הסמפונות mainstem שמאל במיקום המרוחק ביותר (הקרוב ביותר לparenchyma). דחוף את הריאה השמאלית האוורור בצד עם יד שמאל תמרון זה.
  3. השתמש דומוןדפוס # 5 45 ° מלקחיים מעוקלים להפריד עורק הריאה השמאלי מהסמפונות mainstem שמאל בגבולות הטבעיים שלהם. קו הפרדה זה מופיע דק ולבן בין שני מבנים הבודדים.
  4. הפרד ישירות תחת עורק מבלי לעבור דרך הכלי; חלק להחליק את קצות המלקחיים מוחזקים יחד לאורך ההפרדה.
  5. המשך עד קצות מלקחיים להפריד את עורק הריאה השמאלי ואת הסמפונות mainstem שמאל בעליל. רק נקודה קטנה של קצה צריכה להיות מלא דרך. אם ניתן דמיין דם על קצה המלקחיים, אז זה לא באופן מלא ובאמצעות קשירה לא צריכה להיות ניסתה. אחרי שעבר בחלל, עורק הריאה השמאלי שכב על העקומה של המלקחיים. להחזיק בעמדה זו.
  6. משחרר בעדינויות את אחיזת מלקחיים ישרים בוטה (יד שמאל) ולתפוס פיסת תפר חתוך מראש (~ 2-3 סנטימטרים; גודל תפר פוליפרופילן 6-0; Myco רפואי, Cary, NC).
  7. פתח מלקחיים מעוקלים חובקים עורק ריאה שמאלי וגרםתפר ראב. משוך בעדינות בחלל תפר בין עורק ריאה השמאלי והסמפונות mainstem שמאל בתנועה יחסית לעקומה של המלקחיים כלפי מעלה.
  8. לכבול את occluding ריאה השמאלית עם קשר מרובע, יתר הזהירות סניפ של תפר.
  9. צלעות סגורות באמצעות מלקחיים בוטים להחזיק צלעות ותפר פעמים עם פוליפרופילן (monofilament הכחול) גודל 4-0 צורפו ל19 מ"מ, הפוך המעגל 3/8 חיתוך מחט (Myco רפואי, Cary, NC) במלקחיים, ונזהר שלא עור תפר (רק צלעות).
  10. השלם קשר מרובע משוחרר, לנפח את הריאות, מקום על לחץ חיובי בסוף הנשיפה (PEEP; 2-5 CMH 2 O), hyperinflate ריאות קשר אז מאובטח בחוזקה, ולעשות עוד קשר מלא לפני חיתוך שארית תפר. הסר מPEEP ולדמיין למשך 30 שניות כדי לוודא שהריאות לא תקרוסנה. החל 5 טיפין Bupivicaine (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, אילינוי).
  11. עור סגור על ידי נחת דבק רקמות על פצע ולדחוף את העור יחד באמצעות חזרה enד של מוליך קצה כותנה. תן Bupivicaine (2.0 מ"ג / ק"ג תת עורי) באתר של חתך לאחר מכן כל 8 שעות למשך 24 שעות או עד שהחיה תתחדש פעילות נורמלית. כשכבה התת עורית באזור זה היא דקה מאוד, זה לא קל כדי לתפור בעצמו. כאשר דבק הרקמות מוחל והעור הוא דחף את זה ביחד גם סוגר את השכבה התת עורית.
  12. כבה את גז isoflurane אך ממשיך לאוורר את החולדה ל1-2 דקות באוויר חדר עד בואה של תנועה רצונית. ניתק את הצינור קנה נשימה ממכונת ההנשמה ולהבטיח כי העכברוש נושם באופן ספונטני לפני הסרתו.
  13. לנגב Puralube מעיניים עם מקלון צמר גפן ותנועה לפקח והתאוששות. הזרק הידרוכלוריד עצירות (0.05 מ"ג / קילו intraperitoneal, באטלר שיין, דבלין OH). המשך אספקה ​​של משכך כאבים בכל 12 שעות עבור 48 שעות לאחר ניתוח.

5. Cannulation עורק צוואר שמאלי

כדי להעריך את גודל perfus סימפונותיון של הריאה השמאלית איסכמי בנקודתי זמן רצוי לאחר קשירת עורק ריאה שמאלית, להזריק microspheres מתויג דרך עורק הצוואר השמאלי לתוך קשת אב העורקים. הכן את החולדות כאמורות 1-2.

  1. חותך קו אמצע לאורך צוואר, להקהות לנתח לחשוף קנה נשימה ועורק צוואר שמאלי (אתר ההזרקה microsphere).
  2. הכנס קטטר מלא בקצה heparinized מלוח, בוטה של ​​PE20 צינורות (הקיטון דיקינסון, ספארקס MD) לתוך הכלי המחובר למחט 25 גרם, 4-way ברזלים, מזרק 1 מ"ל.
  3. בקבוק מקום microspheres (15 מיקרומטר הארגמן קלקר ניאון microspheres, 1 x 10 6 כדורים / מ"ל; Invitrogen, יוג'ין, OR) בsonicator מים למשך 30 שניות.
  4. הסר בקבוק, מערבולת ולמשוך עד 0.5 מ"ל (500,000 microspheres) למילטון מיליליטר זכוכית מזרק 1 (המילטון חברה, רינו, NV) באמצעות מחט 20 גרם.
  5. צרף מזרק המילטון לברזלי 4-דרך ולהחדיר microspheres עם משאבת מזרק (שיעור: 500 μl / דקה; Genie בנוסף, קנט המדעי, Torringtב, CT).
  6. הסר מזרק המילטון ומכשירים מיושרים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח heparized ב 500 μl / דקה.
  7. מבצע פתיחת בית חזה חזה מלאה ולגרום לדימום מחודש חולדה על ידי ניתוק הווריד הנבוב הנחותה.
  8. הסר את הריאה השמאלית וברקמות אחרות של עניין.
  9. כדי לחלץ microspheres מרקמות, לקחת את כל הריאה השמאלית של העכבר לאחר exsanguination ולמקם אותו בKOH 2M (4-6 מ"ל). מקום באמבטית 55 ° C מים ולהשאיר למשך הלילה לעיכול רקמה. הוסף Tween 80 (0.25%) כדי לשטוף את החרוזים, מערבולת (10 שניות) וצנטריפוגה (2000 סל"ד; 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות). הסר את supernatant, להוסיף תצטט 2-ethoxyethyl (מ"ל 1), מערבולת ולתת לעמוד לשעה 1. מערבולת ההשעיה וצנטריפוגה (2000 סל"ד; (20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות) הסרת שכבת 2-ethoxyethyl יצטטו מימית המכילה את הקרינה, המקום בקובט ומידה באמצעות ספקטרופוטומטר היטאצ'י F-2500 פלואורסצנטי (612/emission העירור 618. ; Digilab, Holliston, MA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גבס כלי דם: תוצאות של ההשפעות של איסכמיה עורק ריאה השמאלית בעכבר מתוארים באיור 1. הראה הוא גבס methacrylate של vasculature הסימפונות וכלי דם הנרחבים של עץ נתיב האוויר השמאלי 28 ימים לאחר LPAL. כדי להשיג את הפסל, מערכת כלי הדם המערכתית הוזרקה תערובת methacrylate (אדום), מדרדרת לתוך אב העורקים היורדים וקנה הנשימה היה cannulated והוזרק חומר מבוסס סיליקון לבן. גבס כלי דם זה מספק הדמיה מדהימה של אנגיוגנזה בסימפונות הריאה. במיוחד ראוי לציון הוא הכלי גדול, מפותל במעלה הז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קשירת עורק ריאה שמאלית בכל המינים שנבדקו מובילה לneovascularization המערכתי החזק של ריאת איסכמי. יש לנו הצגנו את פרטי הגישה כירורגית במודל עכברים. התוצאות שלנו מיוצרות על ידי יציקת כלי דם, היסטופתולוגיה, ובתיוג vivo להוכיח שעורקי סימפונות להתרבות ותנקבנה parenchyma ריאתי. לפיכך, את המנגנונים של אנגיוגנזה סימפונות ניתן ללמוד במודל של בעלי חיים, המקביל למצב האנושי של thromboembolism ריאה הכרוני. יתר על כן, מודל חיה הרלוונטי קליני קטן זה מספק הזדמנות לבחון את הצורה והתפקוד ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

אנחנו מכירים את עבודתו של ד"ר Adlah Sukkar, MD בסיוע עם הליהוק של הריאה. עבודה זו כבר במימון NHLBI, HL088005.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריאגנטים: חברה
hydrochloride עצירות, Puralube שיין באטלר
bupivicaine תרופות APP
swabstick Povidone-יוד Dynarex תאגיד
גודל תפר פוליפרופילן 6-0, מחט המעגל 3/8 הפוכה חיתוך Myco רפואי
PE20 צינורות הקיטון דיקינסון
15 fluorospheres קלקר ארגמן מיקרומטר Invitrogen
1 מ"ל המילטון זכוכית מזרק חברת המילטון
ציוד:
משאבת מזרק פלוס Genie קנט מדעי
ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי Digilab
מאוורר מכרסם דגם 683 הרווארד Apparatus
טבלת 1. טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים.

מקורות

  1. Weibel, E. R. Early stages in the development of collateral circulation to the lung in the rat. Circulation Research. 8, 353-376 (1960).
  2. Li, X., Wilson, J. W. Increased vascularity of the bronchial mucosa in mild asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 229-233 (1997).
  3. Turner-Warwick, M. Precapillary systemic-pulmonary anastomoses. Thorax. 18, 225-237 (1963).
  4. Muller, K. M., Meyer-Schwickerath, M. Bronchial arteries in various stages of bronchogenic carcinoma. Pathol. Res. Pract. 163, 34-46 (1978).
  5. Remy-Jardin, M., Duhamel, A., et al. Systemic Collateral Supply in Patients with Chronic Thromboembolic and Primary Pulmonary Hypertension: Assessment with Multi-Detector Row Helical CT Angiography. Radiology. , 274-281 (2005).
  6. Karsner, H., Ghoreyeb, A. Studies in infarction: The circulation in experimental pulmonary embolism. J. Exp. Med. 18, 507-522 (1913).
  7. Endrys, J., Hayat, N., et al. Comparison of bronchopulmonary collaterals and collateral blood flow in patients with chronic thromboembolic and primary pulmonary hypertension. Heart. 78, 171-176 (1997).
  8. Virchow, V. Uber die Standpunkte in den Wissenschaftlichen Medizin. Virchow Archiv. 1, 1-19 Forthcoming.
  9. Fadel, E., Mazmanian, G. M., et al. Lung reperfusion injury after chronic or acute unilateral pulmonary artery occlusion. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157, 1294-1230 (1998).
  10. Charan, N. B., Carvalho, P. Angiogenesis in bronchial circulatory system after unilateral pulmonary artery obstruction. J. Appl. Physiol. 82, 284-291 (1997).
  11. Shi, W., Hu, F., et al. Altered reactivity of pulmonary vessels in postobstructive pulmonary vasculopathy. J. Appl. Physiol. 88, 17-25 (2000).
  12. Shi, W., Giaid, A., et al. Increased reactivity to endothelin of pulmonary arteries in long-term post-obstructive pulmonary vasculopathy in rats. Pulm. Pharmacol. Ther. 11, 189-196 (1998).
  13. Sukkar, A., Jenkins, J., et al. Inhibition of CXCR2 Attenuates Bronchial Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung. J. Appl. Physiol. 104, 1470-1475 (2008).
  14. Mitzner, W., Lee, W., et al. Angiogenesis in the mouse lung. Am. J. Pathol. 157, 93-101 (2000).
  15. Wagner, E. M., Jenkins, J., et al. Lung and vascular function during chronic severe pulmonary ischemia. J. Appl. Physiol. 110, 538-544 (2011).
  16. Remy-Jardin, M., Bouaziz, N., et al. Bronchial and nonbronchial systemic arteries at multi-detector row CT angiography: comparison with conventional angiography. Radiology. 233, 741-749 (2004).
  17. Baluk, P., Tammela, T., et al. Pathogenesis of persistent lymphatic vessel hyperplasia in chronic airway inflammation. J. Clin. Invest. 115, 247-257 (2005).
  18. Bailey, S. R., Boustany, S., et al. Airway vascular reactivity and vascularisation in human chronic airway disease. Pulm. Pharmacol. Ther. 22, 417-425 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים