מאמר שיטה

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

24K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50295

⸱

25 במרץ 2013

 ,  , 
1Research Department of Cell and Developmental Biology, University College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

תרבויות פרוסות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר על ידי גן והפרעות תרופתיות. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שהתפתחות תקינה יכולה להמשיך בסביבה המופחתת של הפרוסה. אנו מדגימים פרוטוקול המאפשר פיתוח חוט שדרה רגיל להמשיך לפחות 24 שעות.

תקציר

תרבויות פרוסות יכולות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר והן פרמקולוגית באמצעות מניפולציות גנטיות. במערכת המצומצמת הזאת, תופעות לוואי קטלניות פוטנציאליות עקב יישומי סמים מערכתיים ניתן להתגבר. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שתמורת ההתפתחות הנורמלית בתוך הסביבה המופחתת של הפרוסה. יש לנו מתמקדים בפיתוח של חוט השדרה, במיוחד זה של תאי עצב מוטורי בעמוד שדרה. אנחנו מגוונים תנאי התרבות של פרוסות עוף עובר שיטתי מהנקודה שבה תאי עצב מוטורי בעמוד השדרה ביותר שנולדו. אנו assayed המספר והסוג של תאי עצב מוטורי ששרדו בתקופת התרבות ואת עמדתו של הנוירונים המנוע בהשוואה לאלה שבגוף חי. מצאנו כי סוג הסרום וגורמי neurotrophic נדרשו בתקופת התרבות והצלחנו לשמור על תאי עצב מוטורי בחיים במשך 24 שעות לפחות ולאפשר הנוירונים המנוע האלה להגר לעמדות מתאימות בחוט שדרה. אנו מציגים תנאים אלה התרבות והמתודולוגיה של הכנת התרבויות הפרוסות העובר באמצעות עוברי עופות מתהפכות משובצות בagarose ופרוסים באמצעות vibratome.

מבוא

במהלך התפתחות עוברית תקינה, תאים מסוגים רבים ושונים נוצרים אשר חייבת לנדוד מנקודת מוצא שלהם לאן שהם יפעלו בסופו של דבר לאורגניזם הבוגר. בתוך חוט שדרת פיתוח, תאי אב נמצאים באזור חדרית בקו האמצע וליצור הרבה תת סוגים של תאי עצב ותאי גליה postmitotic אשר חייב לנדוד להשתלב מעגלים עצביים פונקציונליים הנדרשים לעיבוד חושי ותפוקות מוטוריות 1. תאי עצב מוטורי בעמוד השדרה ששולטים בהתכווצות של שרירי גפיים נחקרו רב והרבה ידוע של מולקולות ומנגנונים המניעים את היווצרות subclasses השונה שלהם. עם זאת, הרבה פחות ידוע מהמנגנונים שבאמצעותם תאי עצב מוטורי ינדדו, להפריד ולקבל תשומות הסינפטי.

זהות תת סוג הנוירון המוטורי היא רכשה במהלך הפיתוח באופן היררכי. תת נוירון מוטורי יכול להיות מסווג באופן כללי אניעמודות Nto שונים, חטיבות וברכות שמוגדרות על ידי תחזיות האקסון שלהם. רכב עמודות אקסונים פרויקט זה, גם אם שרירי מעי או איבר ציריים. חטיבות רכב לחלק את האיבר מקרין הנוירונים מוטוריים של עמודת מנוע לרוחב (LMC) לאלה מקרינים לשרירי גחון או הגבו 2. בתוך החטיבות, צבירי נוירונים מוטוריים מכונים פרויקט ברכות מוטוריות לשרירים בודדים באיבר 2, 3. הנוירונים מנוע איבר מקרין-מוגדרים על ידי הביטוי של גורם שעתוק Foxp1 4, 5, ואילו זהות חטיבה מאופיינת בביטוי של גורמי שעתוק homeodomain Islet-1 (ventrally מקרין) או Lhx-1 (dorsally מקרין) 6. אכן, Lhx-1 ביטוי דרוש לתחזיות הגב המתאימות של מנוע 7 הנוירונים. כל אחד מתת אלה תופסים עמדות שונות בתוך עמוד השדרה; הנוירונים מנוע מקרינים גחון לבוא להתגורר המדיאלי לdorsally projectiהנוירונים מוטוריים ng. התוצאה היא LMC מתבדלת לLMCmedial נקרא כך (LMCm) וחטיבות LMClateral (LMCl). ארגון ברכת אוגדה והמנוע שנרכש בשני שלבים 8. בשלב הראשון, פרדת אוגדה מושגת באמצעות הגירה של תאי עצב מוטורי במאפיין המדיאלי לאופנה לרוחב. תאי LMCl נוצרים לאחר שתאי LMCm וכן LMCl נודד דרך LMCm להשיג עמדת יישובו הסופית. השלב השני לוקח הנוירונים מנוע בתוך חטיבה ומקבצים אותם לברכות מוטוריות נוירון, ככל הנראה דרך מיון הגבה-גחון של תאי העצב המוטורי. בני משפחת cadherin הקלסי catenin התלוי הוכחו להיות קריטי לשני השלבים של 8-10 מוטוריים נוירון ארגון. עם זאת, איך פונקצית cadherin שולטת על תנועת תא הוא הבין היטב.

הרכישה של זהויות, ומחלקתיות עמודי ברכה דורשת אותות חיצוניים שהדפוס intrinsiביטוי של גורמי שעתוק ג 11. בנוסף, סביב 50% מכל הנוירונים המנוע למות באמצעות אפופטוזיס במהלך התפתחות תקינה בתהליך שדורש אותות חיצוניים מהאיבר, בעיקר באמצעות תמיכת neurotrophic הישרדות הנוירון מוטורי. לפיכך, מנוע נוירון פיתוח דורש הסביבה המתאימה כדי להישמר על timecourse ארוך יחסית. מסיבה זו, את המעשיות של יצירת תרבויות פרוסות בעמוד שדרה כדי לשמור על הישרדות הנוירון מוטורי דורשות הבהרת תנאי התרבות מתאימות. תרבויות פרוסות עובר הקודמות שמשו כדי לעקוב אחר ההתנהלות הוסיפה extrinsically מטוהר אוכלוסיות עצביות 12-14. עם זאת, לתנאי תרבות הידע שלנו, המסייעים בהישרדות אתר המנוע נוירון והגירה בתוך הפרוסה עצמו לא פורסם. אנחנו שונים מצב תרבות סטנדרטית המאפשר ההישרדות של מטוהר, תאי עצב מוטורי גולגולת ניתקו כדי להקל מ 'פיתוח otor נוירון בתוך מערכת תרבות פרוסת עובר. אנחנו גם לנטר את המיקום של תאי העצב המוטורי ששרדו ולהוכיח כי עמדות במידה רבה נורמליות של מנוע נוירון החטיבות נרכשו במהלך תקופת התרבות.

פרוטוקול

1. הפוך פתרונות נדרשים

  1. חיץ 1 ז פוספט:. תשקול את 109.4 גרם Na 2 HPO 4 ו 32 גרמו nah 2 PO 4 H 2 0, לערבב ומתמוסס במים לנפח כולל של 1 ליטר.
  2. נאגר מלוח פוספט (PBS): הכן את חיץ פוספט 0.1 מ ', 0.15 מ' NaCl. 100 מ"ל של PBS צריך להספיק לעיבוד של פרוסות מ10 עוברים.
  3. Agarose: פתרון לחום PBS סביב 70 המעלות צלזיוס ולהוסיף היתוך agarose טמפרטורה הנמוך המוצק תוך לאט תוך ערבוב מתמיד. הפוך פתרון לריכוז סופי של 4% (w / v) agarose. הפוך מלאי של 50 מ"ל של פתרון זה. השאר את הפתרון הזה בwaterbath שמר על 48 מעלות צלזיוס עד שנדרש. כל פתרון שאינו בשימוש agarose לאחר הניסוי ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך מספר שבועות.
  4. פתרון נוגדן בלוק: הוסף עוברי עגל בסרום וטריטון X-100 לconcentr סופיation של% 1 (נ / V) עוברי עגל בסרום, 0.1% (v / v) טריטון X-100 ב PBS. 10 מ"ל של פתרון בלוק יספיק לimmunostaining של 5 מגלשות סעיפי cryostat.
  5. מקבע: הכן 0.75 המ"מ NaOH, 4% (w / v) paraformaldehyde (זהירות). כדי להכין את הכמות הנדרשת של מים מקבע חום עד 70 מעלות צלזיוס, להוסיף NaOH המרוכז לריכוז סופי הנדרש, להוסיף paraformaldehyde ומערבב עד להמסה מלאה. מגניב על קרח עד 4 ° C. 10 מ"ל של הפתרון הזה יספיק ל20 בארות של פרוסות עובר.
  6. פתרון סוכרוז: הכן 10 מ"ל של 30% (w / v) פתרון המכיל סוכרוז פוספט חיץ M 0.1. 10 מ"ל של הפתרון הזה יספיק ל10 בארות של פרוסות עובר.
  7. 70% (v / v) אתנול. לדלל 70 מ"ל של אתנול מוחלט עם 30 מ"ל מים.
  8. בינוני תרבות: הכן את הפתרון של 1% תמצית עוף עובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 0.35% L-גלוטמין, 0.1% 2-mercaptoethanol, 4% עוף סרום, 2% B27 ותוסף גורם 100 ng / ml ciliaryneurotrophic צמיחה (CNTF) כל דילול במדיום neurobasal; הוכן על קרח והשתמש באותו היום. 10 מ"ל של מדיום התרבות נדרש במשך 20 בארות של פרוסות עובר.

2. הכנה עובר אפרוח

  1. מקום ביצים מופרות תרנגולות עם הצד הארוך אופקי בנאלצה טיוטת חממה ב38 מעלות צלזיוס עד שהם מפתחים לשלב 15 24. זה בדרך כלל דורש כ 4 ימי דגירה.
  2. ביום השני של דגירה, לעקר את קליפת הביצה על ידי ניגוב עם נייר טישו הספוג באתנול 70%. זהירות לנקב את קצו השטוח של קליפת הביצה באמצעות מחט 21 מד מחוברת למזרק 5 מ"ל ולהסיר 5 מ"ל של אלבומין. זה מוריד את העובר מקליפה ולכן העובר אינו נפגע בעת הקליפה נפתחה. להחזיר את הביצים לאינקובטור ודגירתם במשך 2 ימים נוספים.
  3. שימוש # 5 המלקחיים דומון הקהה גarefully פירס האמצע העליון של הקליפה ולהסיר סביב 9 סנטימטר 2 של פגז. חותך סביב העובר ומוציא בזהירות את העובר והמקום בHBSS במהלך נתיחה. העוברים צריכים להיות מבוימים על פי המבורגר והמילטון (1992) 15. כל העוברים בשימוש צריכים להיות בקרבת הבמה 24. כל עוברים שמראים כל סימן של חריגות אמורים להיות מושלכים.
  4. הסר את קרום amnion, קרום Chorio-allantoic, הראש, וallantois באמצעות שני דומון # 5 מלקחיים. כסח את העובר כדי להסיר את כל האיברים הפנימיים. כדי לעשות זאת, חתך את קו אמצע הגחון של העובר עם מספריים מבתרים מייקרו, להחזיק את העובר ברחבי אזור תא המטען המקורי עם זוג אחד של מלקחיים, לתפוס את החלק המקורי של הבטן ולב ולמשוך caudally. זה חשוב שזה נעשה בצורה נקיה. אתה אמור להיות מסוגל לראות את העובר באופן ברור somites. חותך את העובר במחצית, רוחבי בין buds.Now הגפיים העליונים והתחתון לקצץ גוף החזיקיר באמצעות מספרי microdissection.

3. הכנה פורס עובר

  1. הסר את פתרון agarose מאמבט המים. לחתוך 5 סנטימטר מהתחתית פנויה 3 מיליליטר פלסטיק פסטר פיפטה.
  2. בעדינות להסיר את החלק המותני של העובר נותח באמצעות שני מלקחיים לעריסה את העובר של פתרון הנתיחה והמקום בצלחת פטרי יבשה. שימוש פסטר פיפטה, הסר סביב 2 מ"ל של agarose, פיפטה כ 0.5 מ"ל בראש של העובר ולאחר מכן למצוץ את פרוסת העובר לתוך פיפטה. להעביר את העובר וagarose לקליפת עובש פלסטיק משם לדאוג שלא להציג את כל בועות בagarose. בעדינות להוריד את העובר לתחתית agarose בתבנית הפלסטיק עם סעיף החזה פונה כלפי מטה. העובר צריך להיות ממוקם ישר ליהיה באמצעות מחט מד 21. את הפרוסות תכלנה גם חלק מהאיבר מתפתח וחשובה שהאורינטציה של העובר באגרOSE יאפשר זאת. הנח את הסירה על קרח כדי להגדיר את agarose. לדאוג שהעובר לא לשנות את הנטייה בתקופה זו (כ 2 דקות).
  3. יקה VT1000S vibratome (3 מהירות, תדירות 4, 400 פרוסות עבות מיקרומטר) צריך להיות מוגדר עם קאמרי חיתוך מלא HBSS ומוקף במים קרים כקרח. אז בלוק agarose תקוע לפלטפורמת vibratome עם דבק סופר. בלוק agarose חיתוך בסכין גילוח להשאיר פיסת העובר עם מ"מ של 1-3 agarose המקיף אותו. את הפרוסות הכוללות סעיפי ניצן גפיים עם ectodermal rigde קודקוד ברור נבחרות והפרוסות האלה אז ממוקמות בHBSS. באופן כללי, יש רק 1-2 פרוסות מתאימות לעובר. סור בעדינות את פרוסות agarose סביב הרקמות באמצעות שתי מחטים. זה חיוני כי זה נעשה ביסודיות ובזהירות.

4. פרוסות Embryo culturing

  1. הוסף 500 מ"ל של תמיסת התרבות (שתואר לעיל) לrequirמספר העורך של בארות של צלחת 24 גם נמוכה במיוחד מצורפת טופלה רקמות תרבות. להעביר את הפרוסות בזהירות מפתרון HBSS לתוך הבאר. באופן כללי, אנחנו מנסים להיות 2-3 פרוסות בכל אחד גם. מניח את הצלחת 24 היטב ברקמות תרבות החממה ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 24 שעות.

5. חתך את הפרוסות לImmunostaining

  1. בעקבות תקופת התרבות, להוסיף 500 μl של תיקון unbuffered לכל באר של פרוסות עובר ולהשאיר על קרח למשך 20 דקות. אז הפתרון הכולל הוא הוציא בזהירות ושלוש כביסות PBS מתבצעות, עם מרווחים 5-min. את הפרוסות אז נעזבות בתמיסת סוכרוז ב 4 ° C, עד לכיור הפרוסות, סביב 6 שעות אך ניתן להשאיר למשך זמן ארוך יותר (למשל בלילה).
  2. הסר את הפרוסות ומספיג off פתרון סוכרוז נוסף ולאזן בסביבת המ"ל 1 אוקטובר לסביבות 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס הר כל דירת פרוסה באוקטובר מולא לקלף תבנית פלסטיק.לאחר ההרכבה, הנח את התבניות בצורה אנכית בקרח יבש לביסוס.
  3. הר אובניים אוקטובר לcryostat ולאזן את הלוקים ב-24 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות סביב. חותך כל פרוסה עם 15 חלקי מ"מ רכובים על שקופיות Superfrost-Plus. שקופיות ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שהם נדרשים.

6. Immunofluorescence

  1. פיפטה 1-2 מ"ל של PBS בשקופיות האופקיות הוחזקו בתא humidified עם השקופיות שהועלו מהעומק של החדר (שאנחנו משתמשים 1 או 2 המ"ל pipettes פלסטיק קבוע עם קלטת חיטוי). דגירת הסעיפים בPBS למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי להסיר אוקטובר העודף הסר את פתרון PBS מהשקופית ולהוסיף 500 מ"ל של פתרון בלוק מעל לקטעים, דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס הסר את פתרון הבלוק ולהוסיף 500 מ"ל של נוגדן ראשוני מדולל מייד הוסיף את השקופיות, דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 18-22 שעות.
  2. הסר פתרון נוגדן ראשוני ומיידh את השקופיות עם 1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות, שלוש פעמים בשעת 20 ° C כדי להסיר פתרון נוגדן ראשוני עודף. הוסף 500 מ"ל של נוגדן משני מדולל על המדורים. את השקופיות ואז הם עזבו ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אז פתרון הנוגדן המשני יוסר והשקופית שטפה 5 דקות 3 פעמים ב PBS על 20 ° C.
  3. בעקבות שטיפות אלה, להסיר את PBS לשטוף הסופי, הנגיעה בקצה של השקופית כדי להסיר PBS העודף, מוסיף שתי טיפין של vectashield בשקופיות ובעדינות להניח coverslip זכוכית על הסעיפים, והימנעות מהיווצרות בועה. הסר Vectashield העודף על ידי סופג מהקצה את השקופיות לפני ההדמיה.

7. הדמיה

  1. תמונת סעיפי immunostained. אנו משתמשים במיקרוסקופ ניקון אקליפס E80i פלואורסצנטי מצויד במצלמת Hamammatsu ORCA ER דיגיטלית ו10 X, 20X ו 40 X עדשות אובייקטיביות.

תוצאות

השימוש בפרוסות תרבית לעקוב אחר ההתפתחות של נוירונים interneuron והקרנה היה השפעה רב בהתקדמות ההבנה של הדור של ארגון בתוך 16 הקליפה שלנו. בחוט השדרה, פיתוח הנוירון מוטורי כבר אחרי שימוש בתרביות של עוברים שלמים 17 דג זברה. עם זאת, עמוד שדרת מנוע נוירון הארגון בדג הזברה הוא יחסית פשוט (בשל חוסר רירי גפיים גדולים בדגים). המנגנונים המולקולריים המניעים את היררכיה של ארגון שדרת המנוע נוירון במהלך הפיתוח של בעלי חוליות גבוהים יותר כעת הם הבינו היטב. תנאי תרבות המאפשרים הישרדות הנוירון והגירת גוף תא בתרבויות פרוסות עובר של בעלי חוליות גבוהות יותר כך נדרשים. נכון לעכשיו, תרבויות פרוסות בחוט שדרה של בעלי חוליות גבוהות יותר היו בשימוש בתאי עצב הזרעים ניתק על גבי הפרוסות 12-14, לחקור אקסונים שכותרתו fluorescently בפריפריה של הפרוסה18, או של התנהגות תא אב בהתפתחות עמוד שדרה בתחילת 19. פורס תנאי תרבות למייתרים מאוחר יותר בעמוד שדרה, במיוחד אלה ששומרים על מנוע נוירון פיתוח כרגע חסר.

כדי לנסות לעקוב אחרי התפתחות עצבית בעמוד שדרה, במיוחד זה של תאי עצב מוטורי בעמוד שדרה, בדק תנאי תרבות שונים שעשויה לקדם את הישרדות תא עצב מוטורי ורכישת ההזמנה ראשונית בארגון המנוע דרך הגירה רוחבית של תאי העצב. ניסויים ראשוניים באמצעות שלב 18 לשלב 20 פרוסות בעמוד שדרה עובר אפרוח העלו חרס; לא היינו מסוגל לשמור על תאי עצב מוטורי בחיים ליותר מכמה שעות ולא הצליח להדגים את הדור של מספרים משמעותיים של תאי LMCl על פני תקופת התרבות (נתונים אינו מוצג). לכן חקרו תרבויות פרוסות של שלב 24 עוברים, timepoint כאשר רוב הנוירונים LMCm LMCl וכבר נוצרו, אבל כאשר LMCl נוירון הגירה היא עדיין באני שלוnfancy (איור 1 א, ג). הגירה לרוחב זה של נוירונים LMCl היא בעיקר מלאה בשלב 27, סביב 24-36 שעות מאוחר יותר (איור 1 df). הבדיקה שלנו ובכך יכולה להיות פשוטה כדי להיות מסוגל לשמור על תאי העצב בחיים וכדי להקל על הגירתם רוחבית לקרן הבטנית. התחלנו הניסויים שלנו עם תנאי תרבות פשוטים יחסית המכילים רק תמיסת המלח המאוזנת של האנק, עם או בלי עוף או סרום תמצית עובר עוף. בכל המקרה, למרות שהצלחנו לשמור על תאי עצב LMC בפרוסה, מצאו מעט עדויות של נוירונים LMCl מתוחזק (לפחות על ידי ביטוי של Lhx-1). בהמשך, מצא ביטוי הולם של גנים כמו HB9 בחוט השדרה הגבה, מצב שלא מתרחש in vivo (מידע לא מוצג). לפיכך, תנאי התרבות פשוטים אלה אינם מתאימים לחקירה של רכישת ארגון הנוירון מוטורי.

כך אנו חפשנו conditio מורכב יותרns ומשמש כבסיס נוסחה שכבר פורסם כדי להקל על ההישרדות של תאי עצב ניתק עוברי עוף גולגולת מוטורית. מצב זה 20 (1% תמצית אפרוח עובר, 1% פן דלקת, 0.35% L-גלוטמין, 0.1% 2-mercaptoethanol, 2% סרום סוס, 2% B27 ותוסף גורם 50 ng / ml ciliaryneurotrophic צמיחה (CNTF) במדיום neurobasal (כאן נקרא גאתרי בינוני) לא להשאיר יותר תאי עצב מוטורי בחיים מאשר התקשורת הפשוטה יותר. בנוסף, הוא לא הביא לביטוי מופרך של גורמי שעתוק בחוט השדרה הגבה. עם זאת, ההישרדות של תאי עצב LMCl הייתה גרועה (איור 1 גי, p). לכן אנו מגוונים מה שאנחנו נחשבים לגורמים מרכזיים במדיום גאתרי, כלומר בעלי החיים ממוצא של הסרום, ריכוז בסרום וריכוז CNTF במדיום. מצאנו כי שינוי הסרום מסוס בסרום לצ'יק סרום ועלייה בריכוז של CNTF מ 50 ng / ml עד 100 ng / ml גדילה במידה ניכר tהוא ההישרדות של תאי LMCl וLMCm וגם אפשר הגירתם לקרן הבטנית מעל שעתי 24 בתנאי התרבות (איור 1 JL, עמ '). המספר הכולל של תאי עצב מוטוריים, היחס לLMCm LMCl ואכן, הנדידה של תאי LMCl לקרן הבטנית הופיע דומה מאוד לקטעים של עוברים שאפשרו לפתח בהאוב ולא בתרבות הפרוסה (איור 1 Ko, עמ '). לפיכך, אנו סבורים כי בהתבסס על גורם שעתוק ביטוי, מספר נייד ואת המיקום של תאי עצב מוטורי, תנאי התרבות הפרוסה לסכם פיתוח נוירון מוטורי רגיל שדרה לפחות במשך שעתי 24.

figure-results-1
איור 1. - ג. מעמדו של הדור של LMC (Foxp1 מכתים בב) וLMCl (Lhx-1 מכתים ב) בשלב 24. ג הוא מיזוג של שני ערוצים. קו האמצע מוצג כקו מקווקו ובפיתוח, V מראה את הכיוון של ציר dorsoventral (D, V) של חוט שדרת ד -. F. . המעמד של LMC (Foxp1 מכתים בד) וLMCl (Lhx-1 מכתים בדואר) ארגון בשלב 27 f הוא המיזוג של שני ערוצים גרם. - אני. Lhx-1 (ז) וFoxp1 (ח) ביטוי בסעיפים של פרוסה בתרבית במדיום שתומך בהישרדות תא מנוע גולגולתי נוירון (בינוני גאתרי, "המדיום הראשוני" ראה התייחסותנו 20). Lhx-1 כבר לא מתבטא בתאי עצב מוטורי, אם כי יש כמה הישרדות של תאי LMC מעידים Foxp1 ביטוי. D, V ב (ז) מראה את הכיוון של ציר dorsoventral (D, V) של חוט השדרה. ML מציג את האורינטציה של ציר mediolateral (M, L) של sj Pinal כבל - אני. תאי LMCl (Lhx-1 בקרן הבטנית בי) וLMC באופן כללי (Foxp1 בk) ניתן להבחין בפרוסות בתרבית במדיום המכיל 4% אפרוח סרום ו100 ng / ml CNTF. שים לב שחלק מתאי LMCl נמצאים בעמדה רוחבית בקרן הבטנית. החץ ב( י) מציג את המיקום הרוחבי של חלק מתאי LMCl. (יב) הוא מיזוג של שני ערוצים מ -. O. מעמדו של ביטוי של Lhx-1 (מ ') וFoxp1 (n) בסעיפים של עובר המשיך באובו בתרבות הפרוסה של העובר מוצג בי - l. (טו) הוא מיזוג של שני ערוצים. P. לכמת את אחוז LMCl (Foxp1 + ve / Lhx1 + VE) לעומת תאי LMC (Foxp1 + ve / Lhx1-ve) תאים הנמצאים בתרבויות פרוסות בתנאים שונים גompared לשלוט עוברים נשמרים באובו (שמייצג 100%). *** מבחן t של הסטודנט מייצג p <0.01. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר פרוסת עובר עוף שדגרה ליותר מיום אחד, תוך השמירה על תאי עצב מוטורי בחיים וממשיכים לנדוד בתקופת התרבות. בהבהרת התנאים כדי לשמור על תאי עצב מוטורי בחיים, יש לנו זוהו מספר תכונות עיקריות הנדרשות. נראה כי עד 4% סרום אפרוח הוא קריטי להישרדות של תאי עצב מוטורי והחלפתה עם סרום ממינים שונים אינו נסבל. מעניין, מצא כי הנוכחות של ריכוזים גבוהים יותר של סרום הייתה מזיקה לפרוסות כמו שהם מקודמים צמיחת יתר של הרקמה שמובילה לעיוותי ברוטו בצורת הפרוסה. וחשוב יותר, את נוכחותו של גורם neurotrophic cilliary גם הוכיחה קריטית. זה נשאר אפשרות ברורה כי את הפרוסות ייתכן שתוכלנה להיות מתורבתים לתקופות ארוכות יותר משמעותי מאשר רק 24 שעות, ואולי אפילו מאפשר הדמיה של קלט חושי מביא לחוט השדרה. בנוסף, המבוי הסתוםתנאי ture כאן יכולים להיות יעילים גם לחתוך תרבויות של גזע המוח והמוח התיכון / מוח קטן מתפתח.

אולי היתרון הגדול ביותר של הפוטנציאל בשימוש בתנאי התרבות הפרוסות הללו הוא שהם מאפשרים את האפשרות למניפולציה תרופתית של תפקוד חלבון ולצמצם למינימום את הפוטנציאל להשפעות שליליות על המנוחה של העובר, כגון לב. מספר גדול של מעכבים ואגוניסטים של מעברי אותות שונים ניתן להשתמש כדי להעריך את ההגירה של תת סוגים של תאי עצב בעמוד שדרה ושונים, באופן פוטנציאלי, השפעתן של ההיווצרות של מעגלי שדרה מקומיים במהלך התפתחות. בנוסף, חלק מהפרעות גנטיות של ביטוי חלבון, כגון אלה שעושים שימוש בoligonucleotides morpholino siRNAs ו, סובלות מהעובדה שהם יכולים רק להיות הציגו בתחילת פיתוח (בשל מגבלות בהליכי electroporation אובו) ואת ההשפעות רק עברו ל תקופה קצרה של טיםדואר (בדרך כלל יום אחד). תרבות הפרוסה שלנו התחיל בשלבים מאוחר יותר ומעניקה את האפשרות להשתמש בטכנולוגיה זו בהמשך הפיתוח בשלב החיתוך לצפייה בהשפעות שלהם בתקופת התרבות של הפרוסה.

פרוטוקול התרבות הפרוסה גם יכול לאפשר ההדמיה של שניהם הנוירון המוטורי בעמוד השדרה, כמו גם הגירת interneuron גב בזמן אמת באמצעות וידאו מיקרוסקופיה זמן לשגות. זאת ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב תחת אור לבן או באמצעות השימוש בדימות פלואורסצנטי. אם טכניקת האחרונים היו לשמש אז ההקדמה של תוויות ניאון היא זקוקים. זאת ניתן להשיג גם על ידי הקדמה של צבעי ניאון כגון DiI או דיו או באמצעות תיוג מדרדר מאיבר או מתיוג האנטרוגרד את החדר או בelectroporation אוב של מבנים לנהוג חלבוני ניאון בקבוצת משנה של הנוירונים.

גילויים

אף אחד מהמחברים שמתחרה אינטרסים או ניגודי אינטרסים.

תודות

ברצוננו להודות ללהתפאר שרון לדיוני תובנה רבים וב Novitch על מתנה מהסוג של הנוגדנים לFoxp1. עבודה זו כממומנת על ידי מלגת לימודים של קרן Wellcome לKCT ומענק פרויקט של קרן Wellcome לSRP (גרנט התייחסות המספר 094399/B/10/Z).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ביצים הנרי סטיוארט חוות, בריטניה ביצי תרנגולת Fertilised בראון Bovan זהב (חוות הנרי סטיוארט, בבריטניה), שהיה מאוחסן בגיל 14 ° C עד דגירה
מחט מד 21 BD-Microlance-3 304432
5 מיליליטר מזרק BD Plastipak 302187
# 5 מלקחי דומון Roboz RS 5045
מספריים לנתח מייקרו Roboz RS 5910SC (3.5 בישר)
תבניות עובר הטבעה: לקלף תבניות אגר מדעי G3764 22 מ"מ בצורת פירמידה עד 12 מ"מ
סופר דבק הכח Flex, Loctite
אתנול SIGMA 32221
סודיום פוספט די מימן, מונה מימה BDH 102454R
סודיום פוספט די מונה מימן VWR / BDH 102494C
כלוריד הנתרן VWR / BDH 27810.295
טמפרטורת התכה הנמוך agarose Invitrogen 16520
סרום שור עוברי Gibco 10500-064
טריטון X-100 SIGMA T8787
נתרן הידרוקסידי FLUKA 71689
Paraformaldehyde VWR / BDH 28794.295
pipettes פסטר פלסטיק חד פעמי ElKay Precision המעבדה מתכלה 127-P503-000 3 נפח Liquipette מ"ל
תמיסת מלח מאוזנת הנקס (HBSS) Gibco 14170
סוכרוז SIGMA S0389
מימן נתרן קרבונט SIGMA S5761
תמצית עוברי עוף Seralabs CE650-J
פניצילין / סטרפטומיצין פתרון Gibco 15070
פתרון L-גלוטמין Gibco 25030
2-mercaptoethanol Gibco 21985
סוס סרום דרום מעבדות קבוצה 9028B
תוסף B27 Invitrogen 17504-044
בינוני Neurobasal Gibco חתול ~ 2103
גורם CilliaryNeurotrophic (CNTF) R ומערכות D 557-NT-010
צ'יק סרום SIGMA C5405
נוגדנים עיקריים נרכשו ממחקרים התפתחותית היברידומה בנק, למעט של נוגדנים נגד foxP1, שהיו מתנה מסוג נט Novitch של אוניברסיטת UCLA. דילולי נוגדנים עיקריים היו ארנב נגד FoxP1 (1/32000), עכבר אנטי Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), גינאה חזיר אנטי FoxP1 (1/1000).
כל הנוגדנים היו מאוחסנים ב 4 ° C.
נוגדנים משניים חמור נגד גינאה חזיר (cy3) (1:1000) נרכש מג'קסון Immunoreseach מעבדות בע"מ חמור נגד מאוס (אלקסה פלואוריד 488) (1:1000), Donkey נגד ארנב (אלקסה פלואוריד 594) (1:1000) נרכש מInvitrogen
כל הנוגדנים היו מאוחסנים ב 4 ° C.
צלחת 24 היטב קורנינג שחקן משנה 3473 צלחת מצורפת ultralow 24 גם
אוקטובר הרקמה Tek, סאקורה 4583 טמפרטורה אופטימלית חיתוך
Vectashield מעבדות וקטור H1000 בינוני Vectashield ניאון הרכבה
שקופיות Thermo Scientific Superfrost פלוס שקופיות טעונות-חיובי, 25 x 75 x 1.0 מ"מ
כיסוי זכוכית VWR הבינלאומי 631-0167 מ"מ 25x60
כפיית טיוטת חממה: חברת חשמל ליון שמר לח על ידי הרמות תמיד מספיקות מים שמוחזקים ב38 ° C הבטחה
Cryostat Brite, Huntingdon, בריטניה -36 ° C
רקמת תרבות חממה ד"ה Autoflow Nuaire 38 מעלות צלזיוס, 5% CO 2
Vibratome ליקה יקה VT1000-S
מיקרוסקופ ניקון מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניקון אקליפס E80i
מצלמה דיגיטלית ניקון ניקון DS5M וHamammatsu ORCA ER

מקורות

  1. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
  2. Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
  3. Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
  4. Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
  5. Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
  6. Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
  7. Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
  8. Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
  9. Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
  10. Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
  11. Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
  12. Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
  13. Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
  14. Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  16. Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
  17. Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
  18. Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
  19. Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920(2012).
  20. Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HBSSOCT

מאמרים קשורים