כאן אנו מתארים טכניקת microdissection אחרי הזרקת הצבע פלואורסצנטי לגנגליון אקוסטית של עוברי חומוס מוקדמים לאיתור סלקטיבי של סיבים שמיעתיים האקסון בעצבים והמוח האחורי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות
במאמר זה
סיכום
תקציר
האפרוח העוברי הוא מודל שימוש נרחב למחקר של תחזיות תא גנגליון היקפיות ומרכזיות. במערכת השמיעה, תיוג סלקטיבית של אקסונים שמיעתיים בתוך עצב גולגולת המחנה השמיני היה לשפר את המחקר של התפתחות מעגל שמיעתי המרכזית. גישה זו מאתגרת, כי אברי חישה מרובים של האוזן הפנימית לתרום לעצב המחנה השמיני 1. יתרה מזאת, סמנים שמבדילים אמין שמיעתי לעומת קבוצות שיווי משקל של אקסונים בתוך עצב המחנה השמיני עופות עדיין לא זוהו. מסלולים שמיעתיים ושיווי משקל לא ניתן להבדיל באופן פונקציונלי בעוברים מוקדמים, כתגובה חושית מעוררת אינן נוכחת לפני המעגלים נוצרים. אקסונים עצב מחנה שמיניים מרכזי מקרינים אותרו בחלק מהמחקרים, אבל תיוג האקסון השמיעתי לווה על ידי תיוג ממרכיבי עצב מחנה שמיני אחרים 2,3. כאן, אנו מתארים שיטה למעקב האנטרוגרד מגנגליון אקוסטי לסלקטיבי Labeאקסונים שמיעתיים הליטר בתוך המחנה השמיני העצבים המתפתחים. ראשית, לאחר נתיחה חלקית של אזור cephalic הקדמי של עובר אפרוח 8-יום שקוע בנוזל השדרתי מלאכותי חומץ, את צינור השבלול מזוהה על ידי ציוני דרך אנטומיים. בשלב בא, micropipette זכוכית משך קנס ממוקם להזריק כמות קטנה של rhodamine dextran אמין לאזור העמוק הדביק וצמוד בו תאי גנגליון אקוסטיים נמצאים. בתוך שלושים דקות לאחר ההזרקה, אקסונים שמיעתיים הם נעוצים מרכזיים למוח האחורי, ומאוחר יותר ניתן דמיינו לאחר הכנה היסטולוגית. שיטה זו מספקת כלים שימושיים למחקרים התפתחותיים של ציוד היקפי להיווצרות מעגל שמיעתי מרכזית.
פרוטוקול
1. הכן את כלי הנתיחה בעקבות ריאגנטים
- נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF; 130 המ"מ NaCl, 3 המ"מ KCl, 1.2 mM KH 2 4 ת.ד., 20 המ"מ 3 NaHCO, 3 HEPES מ"מ, גלוקוז 10 מ"מימ, 2 המ"מ CaCl 2, 1.3 המ"מ 4 MgSO) חדור ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2 בטמפרטורת חדר. לעירוי, למלא כדי 2/3 צנצנת 500 מ"ל Nalgene פה רחב עם חור במכסה. טנק יצורף בצינור לזכוכית גזע bubbler, החודר את aCSF דרך החור במכסת הצנצנת. התאם לחץ להשגת זרם בלתי פוסק של בועות שמגיעות כ 1/3 מכמות הנוזלים, אבל הם לא חזקים מספיק כדי לגרום להתזה מעל לשפה. הצף 5 בקבוקוני זכוכית מ"ל (עד 6) לצנצנת Nalgene להפריד דגימות בודדות אחד מהשני וממערבולות זרימת הגז. ACSF יש חמצן במשך לפחות 20 דקות לפני כל דגירת רקמות.
- מנת נתיחת סיליקון קטנה (35 x 10 מ"ממצופה מ"מ פטרי באמצעות Sylgard Elastomere קיט) עם שתי סיכות נתיחה להציב לתוך קלקר משושה קטן (47 מ"מ תחתון) שוקל סירה.
- שני מלקחיים-מחט דקה, אחד קצה מעוגל מלקחיים, כוס מ"ל 50, ומכל לפסולת רקמות.
- משך הזכוכית micropipette (1.2 OD / 0.9 ID) נשבר לכ 20-50 מיקרומטר פתיחה בקצה ומלא בrhodamine dextran אמין (RDA, MW = 3000, Invitrogen) בפתרון 6.25% עם 0.4% Triton X-100 ב PBS . צרף ידי צינור דק לpicospritzer ולייצב לmicromanipulator.
2. מייקרו נתיחה כדי לחשוף פטמית basilar בE8 4,5
- עם מלקחיים מעוקלים, לחתוך E8 עובר מתחת לגזע המוח, מניח את הראש ישירות על גבי צלחת נתיחת סיליקון מצופה במשקל סירה.
- שימוש בסיכות נתיחה, למקם את הראש עם נוף גחון כך האוזן בצד של עניין היא מעט גלויה, הראש מוטה מעט dorsally ומצביע מרחק 10-30 מעלות מcenter (איור 2 א). מייד לאבטח את הראש עם סיכות. אם הבילטרלי מעקב הוא רצוי, מרכז הראש ב0 מעלות, או נוף גחון מלא, כך ששני הצדדים יכול להיות נגיש. בדומה לכך, להזרקת צד שמאל, לאבטח את הראש ב-10 מעלות ל-30 ממרכז כך בצד השמאל הוא נגיש.
- שימוש בכוס המ"ל 50, להעביר 30 מ"ל של aCSF חומץ לתוך התבשיל, משקע את הרקמה באופן מלא.
- עדינות לתפוס ולקלף את הלסת התחתונה באמצעות מלקחיים-מחט דקה, ואז להסיר את העפעף התחתון בצד של עניין.
- הסרת רקמת כלי הדם שמעליו, לרבות כל חיך וושט שנותר. רקמות רכות אלה צריכות לקלף חושפות את משטח החלק של פיתוח chondrocranium עם עורקי החוליות הייחודיים בשטח שלו. בשלב זה, מסת otoconial הלבנה האופיינית צריכה להיות גלויה.
- זהירות לנתח את העור סביב meatus החיצוני, הסחוס של מפרק הלסת, והאוזן התיכונה תוך השארה באוזן נר שלמה. השתמש במלקחיים בעדינות כדי לחתוך מבני סחוס אלה.
- הסר עורקי חוליות ודם וריכוז באמצעות תנועה גורפת עדינה עם טיפי מלקחיים העדינים. דם יכול לטשטש נוף וקרישה עשויה לסתום את פתח פיפטה הזרקה.
- צינור השבלול עם האפיתל סמוך חושי (basilar פטמית) וגנגליון אקוסטית נמצא ישירות מתחת chondrocranium 6 ויכול להיות דמיינו כמו הקרנת אצבע דמוית מוארכת המשתרעת מהאוזן הפנימית ventrally, עם הדיסטלי ביותר טיפ (שיא) ליד הקדמי קו אמצע 5. אולי יש איגום קטן של דם (אדום) מהנתיחה ו / או הסתיידויות otolithic (לבן) בקודקודו של צינור השבלול (איור 2 ב ') שיכול לסייע בהדמיה. בשיא היא המקולה lagenar, תיקון חושי חשב להיות פונקציה של שיווי משקל 7,8.
3. תיוג סלקטיבי של סיבים שמיעתיים שמיניים CN
- הנח את הפיפטה ההזרקה הקרובה לפני שטח העובר באזור פטמית הדביקה וbasilar השבלול.
- לאט לאט להוריד את micropipette לנקב 1 הגולגולת. אזור גולגולת זו הוא דק יותר מאזורים סמוכים ודורש פחות כוח לחדור. Micropipette צריך עכשיו להיות בתוך צינור השבלול. אופציונלי: זריקה קטנה של העתקת צבע יכולה להתבצע כאן כדי לסייע בהמחשת פטמית הבסיס.
- מבלי למקם מחדש את micropipette, להמשיך ולהוריד עד שהוא רק פרות הגבול העמוק של צינור השבלול (איור 1). לבצע הזרקה כאן ולחזור בכמה אזורים לאורך basilar פטמית (התרשימים 2C, 2D), למעט הקצה הפרוקסימלי ביותר בי lagena שיווי המשקל הוא ממוקם. עם picospritzer נקבע בין 10-30 psi, כמה זריקות נעשות. נפחיו של נוזל צבע מוזרק משתנים, ותלויים במידה של תיוג רצוי. כל זריקה אמורה לגרום פלורסנט לצבוע להנקודת beled של כ 200-400 קוטר מיקרומטר (האיור 2D).
- לאחר ההזרקה היא מוחלטת, להשתמש במלקחיים ויחצו המדגם מעל גזע המוח ולהשתמש פיפטה העברה למקום חלק הזנב לתוך צנצנת קטנה בתוך המכל של aCSF הרף perfused עם 95% O 2/5% CO 2.
- לכל עוברים, לאפשר 20-30 דקות להעברת צבע, בהתאם למרחק ממרכז המעקב הרצוי.
- הסרת רקמה ולהתכונן לחתך היסטולוגי. בדוגמא שמוצגת כאן, רקמה היא שקועה בparaformaldehyde 4% (ב1X PBS) סוכרוז הלילה, 30% (ב1X PBS) למשך הלילה.
4. Counterstaining וניתוח
- Counterstaining שימושי שיעזרו לכוון את הצופה למיקום האנטומי כמו גם לזהות אזורים מסוימים של עניין. Counterstain יעיל בהכנה הזאת היא immunolabeling neurofilament (איורים 1, 3B, 3E), אשר בתוקף labels אקסונים ומאפשר לתיחום של שטחי axonal במערכת העצבים המרכזיים.
- ניתוח צריך להתבצע בכל האזור שכותרתו, כמו את התחזיות יכולות להאריך כמה מאה מיקרונים או יותר לאורך ציר rostrocaudal. להלן כמה דוגמאות לניתוחים בסיסיים הן: שיעורי שגיאת מיקוד, עיתוי ו / או שינויים בסטייה של דפוסי הקרנה. אקסונים RDA כותרת-הם דמיינו במערכת העצבים ההיקפית ומרכזית ברזולוציה גבוהה (3A דמויות, 3D).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המרכיבים של עצב המחנה השמיני ואת האנטומיה של העצב עצמו מורכבים ומפותלים (איורים 1, 3). על ידי התחקות סיבים הנובעים מתאי הגנגליון אקוסטיים סלקטיבי, קטעים של עצב המחנה השמיני, כמו גם afferents השמיעתי העיקרי בתוך גזע המוח ניתן לייחס באופן נקי ונבדלים ממקביליהם שיווי משקל (איורים 2, 3). כמו כן, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור תחזיות היקפיות של תאי הגנגליון אקוסטיים (איור 3G), או שונה ללמוד תחזיות נובעות מאיברי שיווי משקל בודדים. בגלל ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים על ההתפתחות המוקדמת של עצב המחנה השמיני היו מוגבלים בחלקו בשל הקושי בזיהוי האקסונים עובריים הנובעים מגרעינים מובחנים מרובים. מספר מחקרים בחנו את האותות המולקולריים המנחים שמיעתי ותא חושי שיווי משקל וגורל תאי הגנגליון במהלך ההתפתחות המוקדמת, אבל 5,11,12 התהליכים ויסות עצבוב מרכזי עדיין לא נקבעו. דיווחים על תחזיות תא גנגליון אקוסטיים בדרך כלל מתארים את התהליכים היקפיים לאפיתל חושי 13-15, ואילו פחות ידוע על התהליכים המרכזיים מקרינים לגרעין ראשוני. מחקרים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים מוכרזים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לד"ר קנדיס היישה להצעות וסיוע בטכניקות הדמיה ודוריס ד"ר וו במומחיות על האנטומיה של אוזן פנימית אפרוח במהלך ההתפתחות עוברת מוקדם. עבודה זו נתמכה על ידי NSF IOS-0642346, NIH-T32 DC010775, NIH-T32 GM008620, NIH R01-DC010796, וDOE GAANN P200A120165.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
שימוש במהלך דגירת aCSF לשמור דגימות נפרדות זה מזה ומן הזרם המבעבע
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב / חומרים | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| פוליסטירן לשקול דיש | הפישר סיינטיפיק | 02-202-101 | |
| צלחת פטרי, 35 10 מ"מ X | הפישר סיינטיפיק | 50820644 | השתמש כדי להפוך את המנה לנתיחת סיליקון |
| ערכת סיליקון אלסטומר Sylgard | מכשירי Precision העולם | SYLG184 | מעייל פטרי כדי להפוך את מנה לנתיחה |
| סיכות נתיחה | שונה | מחזיק עובר במקום במהלך הנתיחה | |
| NaCl | שונה | חלק ממתכון aCSF | |
| KCl | שונה | חלק ממתכון aCSF | |
| KH 2 PO 4 | שונה | חלק ממתכון aCSF | |
| 3 NaHCO | שונה | חלק ממתכון aCSF | |
| גלוקוז | שונה | חלק ממתכון aCSF | |
| CaCl 2 | שונה | חלק ממתכון aCSF | |
| MgSO 4 | שונה | חלק ממתכון aCSF | |
| מכל לaCSF. הצע פה רחב Nalgene צנצנת שקופה, 500 מ"ל (16 מ"ל) עם מכסה. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | פתיחה לקדוח חור בחלק העליון של מכסה לגזע הזכוכית bubling לחדור נוזל |
| בקבוקון ריק 5 מיליליטר זכוכית או בקבוקון שקוף להשוות | תרופות אמריקניות שותפים, Inc | 6332300105 | |
| טנק של carbogen (95% O 2/5% CO 2) מחובר בצינור לbubbler | שונה | צרף בצינור לbubbler גזע הזכוכית לעירוי לתוך aCSF | |
| זכוכית הגזע bubbler | שונה | להחדיר לתוך carbogen aCSF | |
| מלקחיים מעוקלים בקצה | מכשירי Precision העולם | 501008 | כדי להסיר את ראש עובר מביצה |
| שני מלקחיים עדין קצה | מכשירי Precision העולם | 501985 | למייקרו נתיחה |
| 50 מיליליטר כוס | שונה | ||
| Rhodamine dextran אמין (RDA) | Invitrogen | שונה | פלורסנט האקסון נותב |
| טריטון X-100 | Biomedicals ICN | ||
| פוספט נאגר מלוח, (1X PBS) | שונה | ריאגנט מעבדה הרגיל | |
| קיר דק זכוכית נימים, 1.2 OD, .9 ID 4 "(100 מ"מ) אורך | מכשירי Precision העולם | TW120F-4 | טען עם RDA. כל נימים עושות שתי micropipettes זכוכית |
| מחט / פיפטה חולץ | דוד קופף מכשירים | דגם 720 | הגדרות בשימוש: חום 16.4, 2.2 סולנואיד |
| Picospritzer | פארקר מכשור | שונה | צרף ידי צינור דק לזכוכית micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | שונה | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם Dissection | שונה | ||
| 4% Paraformaldehyde | שונה | ריאגנט מעבדה הרגיל | |
| נוגדן אנטי Neurofilament, אופציונלי | Millipore | AB1991 | עקוב פרוטוקול היסטולוגית מומלצים על ידי יצרן |
| Cryostat וחומרים הקשורים לחתך | ליקה | שונה | |
| מיקרוסקופ Epifluorescent להדמיה | Zeiss, שונה |
מקורות
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144(2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
