מאמר שיטה

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

DOI:

10.3791/50310

⸱

4 באפריל 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים יכולים לחוש ולהעביר לריכוזים גבוהים יותר של רמזים דבקים כגון גליקופרוטאינים של מטריקס ורמזים מסיסים כגון גורמי גדילה. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת שיפועים מנוגדים של רמזים דבקים ומסיסים בתא microfluidic, אשר תואם עם הדמית תא חייה. קופולימר של פולי-L-ליזין ופוליאתילן גליקול (PLL-PEG) הוא מועסק passivate coverslips זכוכית ולמנוע ספיחה הלא ספציפית של ביומולקולות ותאים. , הדפסת microcontact הבאה או לטבול יתוגרפיה עט המשמשת ליצירת רצועות של streptavidin על משטחי פסיבציה לשמש כעיגון נקודות לפפטיד החומצה ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD) biotinylated כמקל דבק. מכשיר microfluidic ממוקם על פני השטח השונים ומשמש ליצירה הדרגתית של רמזים דבקים (100% RGD לRGD 0%) על מסילות streptavidin. לבסוף, באותו המכשיר microfluidic משמש ליצירת שיפוע suc chemoattractantח כסרום עוברי שור (FBS), כאות המסיסה בכיוון ההפוך של השיפוע של רמזים דבקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאי בימוי היא מאפיין בסיסי של תאים רבים והיא היבט מרכזי של תהליכים פיסיולוגיים רבים נורמלים, כולל התפתחות עוברית, הגנה מפני זיהומים וריפוי פצעים. בנוסף, נדידת תאים גם ממלאת תפקיד מרכזי במחלות רבות כגון מחלות לב וכלי דם, גרורות של תאים סרטניים ו1,2 דלקת כרונית. בעוד המדינות הקלסיות של נדידת תאים - הקיטוב, מאריך בליטה, היווצרות הידבקות, דור כוח והנסיגה אחורית - מתקבלות בדרך 3,4, הבהרת מנגנוני חלל ובזמן שבו שילוב האות תואם כבר יותר מאתגר.

מטריקס (ECM) משמש כמצע להדבקת תא, ובכימי גלומים 5 ו 6 גיוון פיזי, מספק רמזים כיוונית לתא ניווט 7,8. בנוסף לרמזים האלה דבקים 9, גורמים מסיסים 10-12 </ Sup> כגון כמוקינים וגורמי גדילה יכולה לגרום לנדידת תאים נוהל באמצעות קולטנים chemoattractant ואיתות motogenic מורד הזרם שלהם. נכון לעכשיו, לא ידוע האם התקשרות ואיתות דרך הקולטנים הידבקות (כלומר integrins) או קולטנים chemoattractant, כגון טירוזין קינאז רצפטור (RTK), הן דומיננטית. זה גם לא ידוע אם היררכיות של מערכות רצפטור הן ספציפיות סוג תא.

מיקרוסקופיה תא חייה מעניקה שפע של מידע שאינו נגיש במבחנים בתפזורת וניתן בשילוב עם מכשירי microfluidic לייצר גרדיאנטים של רמזים משותקים 13,14 ומסיסים 15 16. השיטה המתוארת כאן מנצלת סדרה של צעדים פשוטים ומקובלים לשינוי פני שטח בשיתוף עם קאמרי microfluidic זמינה מסחרי כדי ליצור assay הדמיה לנדידת תאים שיכול בקלות להיות מיושמים במעבדת ביולוגיה של תא (איור 1). התאסףמכשיר microfluidic יש איכויות אופטיות הניתנות להשוואה לזכוכית 17 והשיפועים של מולקולות diffusible הם יציבים במשך לפחות 16 שעות. המערכת יכולה לשמש לשיטות מיקרוסקופיה epifluorescence ומתקדמות. בניגוד setups Chemotaxis האחר 18, מערכת זו היא מתאימה להקלטה נודדת לאט תאים, נדבק. חשוב לציין, המערכת היא מודולרית, ומאפשרת בקלות את ההקדמה של דבק חלופי או רמזי הגירה מסיסים ובחינה של סוגי תאים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פסיבציה של Coverslips זכוכית עם PLL-PEG-ביוטין

צעד זה נועד passivate פני השטח כך שתאים לדבוק ונודדים אל אזורים ספציפיים על coverslip הזכוכית שנוצרים עם הדפסת microcontract (שלב 2-3 א) או לטבול יתוגרפיה העט (שלב 3 ב). לפסיבציה, שיתוף פולימר של פולי-L-ליזין (PLL) ופוליאתילן גליקול (PEG) משמש בו 20% ממולקולות PEG הם השתילו לביוטין (PLL-PEG-יוטין).

  1. כדי לנקות coverslips הזכוכית (18 מ"מ x 18 מ"מ), משקיע אותם במדף באתנול 100% ולהציב את המדף באמבטית sonicating למשך 30 דקות. ייבש את coverslips הזכוכית באוויר או מתחת לזרם של חנקן.
  2. בשלב הבא, sonicate את coverslips הזכוכית עבור 30 דקות בM NaOH 1. לאחר מכן יש לשטוף את משטחי זכוכית על ידי טבילת המדף בזהירות בכוס מלאה ב1.5 הליטר מילי-Q H 2 O. חזור על תהליך שטיפת שלוש פעמים באמצעות טרי מילי-Q H 2 O בכל פעם. ייבש את הזכוכית בcoverslipsתנור ב 60 ° C.
  3. מניח מחצית הזכוכית הנקיה coverslips בנפרד בתא לח, שעשוי מצלחת 24 גם מלאה חלקית עם H 2 O. ירידה של 15 μl של PLL-PEG-ביוטין (1 מ"ג / מ"ל) ב PBS על כל coverslip זכוכית. קח את החצי השני של coverslips הזכוכית הנקיה שנותר ובזהירות כריך פתרון PEG. השאר את coverslips לשעה 1 בתא הלח. הסט את coverslips הדחוק בעדינות אחד מהשני ללא מגרד את פני השטח PEG המצופים ולשטוף אותם עם מילי-Q H 2 O. המים צריכים להחליק בקלות בצד PEG-טופל. במידת צורך, את coverslips אוויר היבש במגבת נייר הזכוכית עם פני שטח המטופלים פונה כלפי מעלה. אחסן את coverslips הזכוכית בתא ייבוש ואקום עד לשימוש נוסף.

2. המצאה של חותמות להדפסת microcontact

אנו מתארים שני תהליכים למסלולי streptavidin דפוס על גבי זכוכית coverslips פסיבציה. הראשון, כניסת המיקרופוןהדפסת rocontact, בדרך כלל דורשת ייצור של אדון סיליקון שממנו חותמת PDMS נפלה. במקרה שלנו, הדפוס על בול PDMS הם 100 קווי רוחב מיקרומטר שהם מרווחים 290 מיקרומטר מרכז למרכז בגובה תכונה של 25 מיקרומטר. בהמשך, נתאר בקצרה כיצד לפברק אדון מתאים סיליקון (שלב 2.1-2.3) וחותמת PDMS (שלב 2.4). עם זאת, קיימים פרוטוקולים מרובים עבור הדפסת microcontact תוארו בספרות 19-23, אשר מתאימות להדפסת תבניות חלבון על coverslips זכוכית. מאסטרס יכול גם להיות מותאם אישית עשה ונרכש ממקורות מסחריים.

  1. ראשית, לנקות את פרוסות סיליקון (4 "בקוטר) על ידי הדגרתו בפתרון Piranha (03:01 v: v של חומצה גופרתית ומי חמצן 30%). במשך 20 דקות יש לשטוף ביסודיות הרקיק 10 פעמים עם MilliQ H 2 O. ייבש את הפרוסות בתנור בחום של 150 מעלות CO / נ
  2. שוטף את הפרוסות נקיות ויבשות סיליקון עם אצטון 100%, ואחריו באלכוהול רפואי 100%. הבא2 מיליליטר ספין מעייל של GM1070 SU-8 photoresist (Gersteltec Sarl) על גבי פרוסות סיליקון ב3100 סל"ד ל 40 שניות כדי ליצור שכבה עבה מיקרומטר 25. אז המדגם אפה על צלחת חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחרי 5 דקות נוספות ב 95 ° C.
  3. לחשוף את SU-8 photoresist לאור UV במשך 60 שניות תחת photomask עם התבנית הרצויה (לדוגמה באמצעות Quintel Q6000 מסכת aligner) וחזור על תהליך האפייה לתאר ב2.2. אז המדגם הוא פותח על ידי טבילה ברקיק SU-8 מפתח (Gersteltec Sarl) במשך 4 דקות, נשטפו באלכוהול רפואי 100% והתייבשו תחת זרימת חנקן. האזור של photoresist SU-8 שלא נחשף לקרינת UV ובכך הוסר, יצירת התבנית ההפוכה של בול PDMS.
  4. השלב הבא הוא להטיל חותמת PDMS מן אדון סיליקון. ראשית, ביסודיות לערבב חלק 1 (w / w) של סוכן הריפוי עם 10 חלקי prepolymer אלסטומר (Sylgard 184). כדי להסיר כל בועות אוויר, דגת התערובת בתא ייבוש המצורף לקו ואקוםלשעה 1. בשלב הבא, שופך אלסטומר PDMS על אדון סיליקון בתוך צלחת הפטר לכ 1 סנטימטר בגובה ולרפא את התערובת ואדון PDMS בתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס במשך השעה 1. לבסוף, חותמת PDMS יוסרה מאדון סיליקון ולחתוך לגודל.

3. Streptavidin דפוסים או רמזים דבקים על Coverslips הזכוכית פסיבציה

לאחר passivating coverslips זכוכית, דפוסי חלבון מודפסים עם הדפסת microcontact (3a סטפ) או ליתוגרפיה מטבל עט (שלב 3 ב). במקרה שלנו, streptavidin מודפס כקווים, המהווים את הבסיס לשיפועי RGD (שלב 4). אותו הנוהל יכול לשמש גם להדפסת חלבוני מטריצה ​​ליצור דפוסים דבקים.

שיטה חלופית להדפסת microcontact לדפוסים של ביומולקולות על משטחים היא לטבול יתוגרפיה עט. בטבילת יתוגרפיה העט, שלוחה משמשת להעברת נפח קטן של פתרון על פני השטח. גודל cantilevers, viscosity מהפתרון, פנה זמן של השלוחה על פני השטח, hydrophobicity של פני השטח והלחות בתא הדפוס לקבוע את הגודל של התכונות המודפסות. יתרונה של שיטה זו הוא שדפוסים שונים ניתן להדפיס עבור כל ניסוי, שכן אין צורך לפברק אדונים ובולים. החסרון הוא שזה לוקח יותר זמן להדפיס דפוס נתון ושטבילת יתוגרפיה העט דורשת מכשיר מומחה שלא יהיה זמין במעבדות רבות. מכשיר יתוגרפיה בעט שהשתמשנו היה NanoeNabler מBioforce הנם. כאן, אנו מודפסים נקודות קטנות שהיו <10 מיקרומטר בקוטר, שעבורו השתמש SPT10 cantilevers.

3 א. Microcontact הדפסת טכניקה (μCP)

  1. לנקות ולהפוך את חותמת PDMS הידרופילי יותר, לטפל בצד הדוגמת מבולי PDMS בUV ואוזון (לדוגמא Procleaner, UV אוזון מBioforce הנני) עבור 1.5 שעות. לחלופין, השתמש בפלזמהמנקה לזמן קצר יותר לאותה המטרה. תהליך זה יוצר חמצון PDMS 24 פני שטח, אשר משפר את תהליך ההדפסה.
  2. מייד לאחר הטיפול באוזון או פלזמה, המקום והתפשטו 10 streptavidin μl (1 מ"ג / מ"ל ​​ב PBS) על גבי בולי PDMS ולהשאיר לשעה 1 בתא לח (כגון צלחת 6-גם מלאה חלקית, ראה שלב 1.3) . אם רצועות צריכות להיות גלויות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי, השתמש streptavidin שהוא מצומדת לfluorophore כגון streptavidin-AlexaFluor350.
  3. הסר streptavidin העודף מהבול ​​בממחטות נייר ואוויר ייבש את החותמת לכ 1 דקות. לחץ קל על חותמת coverslip הזכוכית PLL-ביוטין המצופה PEG.
  4. אם ניאון streptavidin שמש ב3.a2 השלב, לבחון את דפוס שימוש תחת מיקרוסקופ epifluorescence. אחסן משטחים מודפסים בייבוש.

ב 3. טובלי יתוגרפיה העט

  1. ראשית, לערבב חלק 1 של 1 מ"ג / מ"ל ​​או streptavidin streptavidin-AlexaFluor350 עם 10 חלקים של גליצרול (v / v) ולטעון 5 μl של התערובת על השלוחה. ואז להתחיל בתהליך ההדפסה, כמתואר במדריך לפעולת מכשיר יתוגרפיה בעט. כדי להקטין את גודל המקום לכ 5 מיקרומטר, להתאים את מהירות הדפסה, לפנות זמן של השלוחה על פני שטח או אנכי המרחק של השלוחה אל פני השטח. בדוגמא שמוצגת באיור 2 ג, נקודות הודפסו בקנה אחד עם שורה ועמודת הפרדה המוגדרת 10-15 מיקרומטר. מרחק זה הוא מספיק כדי למנוע נקודות ממתמזגות זה בזה, אך מאפשר צפייה בנקודות מרובות בשדה אחד של נוף עם רוב ההגדרות המיקרוסקופ.
  2. אחסן משטחים מודפסים בייבוש.

4. יצירת Gradients דבק על משטחי streptavidin-דפוס

אנו יוצרים גרדיאנטים דבקים של ביוטין RGD-coverslips על הזכוכית כי הם מצופים בstreptavidin (3 איור) או שיתוףדפוסי ntain streptavidin על coverslips הזכוכית פסיבציה (איור 5). כדי ליצור שיפוע פני שטח, השתמש מכשיר microfluidic זמין מסחרי (הנקרא דביקה שקופיות Chemotaxis 3D מIbidi) שיוצר שיפוע פתרון יציב על ידי דיפוזיה פסיבית. להתחרות על אתרי הקישור streptavidin העסקנו 2 שיפועים מנוגדים של ביוטין-RGD וביוטין שלא היו מוצמד לRGD (ראה תרשים 1).

  1. צייה את coverslips הדוגמת או זכוכית streptavidin המצופים אל הצד הדביק של מכשיר 3D-Slide הדביק Chemotaxis. כדי לוודא שאין דליפה לכמה שעות, את הקצוות של המכשיר אטומים בשכבה דקה של וזלין התחמם ועם שכבה שנייה של תערובת של חלק 1 של וזלין לחלק 1 של שעוות פרפין (w / w).
  2. מלא הערוץ של המכשיר עם 6 PBS μl בערוץ. ואז למלא את שני מאגרים עם 70 μl של 0.03 מיקרוגרם / μl ביוטין-4-fluorescein ב PBS ו70 & mu; הליטר של 0.03 מיקרוגרם / μl ביוטין-RGD ב PBS, בהתאמה. דגירת הדגימות בRT בחושך לשעה 1.
  3. הסר את פתרוני ביוטין ולשטוף את המשטח בזהירות תוך עדיין מחובר למכשיר microfluidic פעמים עם PBS. סמן את כיוון שיפוע הדבק ואם יש צורך, לאחסן את המכשיר מלא PBS ב 4 ° C לאך יש לוודא שהמכשיר לא יתייבש. במידת צורך, לנתח את שיפוע הדבק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. Labelling של תאים עם fluorophores להדמית תא חייה

תאים מסומנים עם צבעי ניאון המסייעים מעקב תא מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקות נפוצות הן סמני אברון ניאון, כגון Syto 64 אדום, שמתייג את גרעין התא. לשם כך, תאים נשטפים 1 שלוש פעמים עם PBS, אז מודגרות עם 64 מיקרומטר אדומים 1 Syto בתקשורת התרבות עבור 45 דקות ולבסוף שטפו שלוש פעמים נוספות עם PBS. שים לב שתאים לא צריכים להיותהמשיך בPBS לתקופות זמן ארוכים.

צבעים חלופיים למעקב תא הם סדרת CellTracker שכתם ציטופלסמה ונשמרים במהלך נדידת תאים וחטיבה. Transfection של תאים עם חלבון היתוך ניאון שימושי במיוחד כדי להקליט את הפצות subcellular של חלבון של עניין במהלך נדידה. עם זאת, בדרך כלל חלבוני ניאון צילום אקונומיקה מהר יותר מאשר צבעים אורגניים, כך שתצפיות ארוכות הטווח עשויים להיות בלתי אפשריים.

6. טעינה של תאים בצבע מסיס להתקני מיקרופלואידיקה

  1. ספירת תאי fluorescently הכותרת והתפצל לשני צינורות של מספרים סלולריים שווים. שטוף וresuspend שפופרת אחת של תאים עם מדיה המכילה chemoattractant, כגון הנשר השתנה בינוני הנמוך של גלוקוז Dulbecco (DMEM) עם סרום שור עוברי (10% FBS). שטוף וresuspend צינור האחר של תאים בתקשורת בלי chemoattractant, כלומר DMEM עם 0% FBS. הריכוז הסופישל תאים בכל צינור צריך להיות 5 x 10 5 תאים / מ"ל.
  2. הסר את כל הפתרונים ממכשיר microfluidic (משלב 4.3) ומניח אותו על במת מיקרוסקופ (ראה שלב 7). טען 70 μl של תאים (5 10 5 תאים / מ"ל x ב 0% DMEM FBS) לתוך מאגר אחד ו70 μl של תאי הלה (5 ​​10 5 תאים / מ"ל בx 10% DMEM FBS) לתוך אחר. רופף למקם סרט על המאגרים, כדי למנוע אידוי. אם תאים על פני השטח הם מראש מודגרות לפני ההדמיה, רצוי שהתאים נטענים למכשיר בתקשורת צמיחה ללא שיפוע. אז המכשיר מונח על במת מיקרוסקופ והתקשורת הוחלפה בשיפוע התקשורת כלומר ללא DMEM FBS באחד מאגרים וDMEM עם 10% FBS ביד השנייה.

7. חי הדמית תא וניתוח נתונים

  1. הפעל את המיקרוסקופ (ניקון TI-E) ולחמם את שלב שעות לפחות 1 לפני תחילת הניסוי.
  2. ודא שהערוץ של micrמכשיר ofluidic הוא בשדה הראייה ותאים נמצאים בפוקוס. בחר פרמטר רכישת תמונה כגון זמני חשיפה ומסנני ניאון, רצף תמונות של שדה ופלואורסצנטי הבהיר שלוכד תאים ומסלולים כמו גם נקודתי זמן ואורך הקלטה (למשל כל 15 דקות במשך 16 שעות).
  3. נתח את הנתונים עם תוכנות מתאימות, כגון מעקב ImageJ הידני או Ibidi Chemotaxis וכלי להעברה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין כיצד תא לשלב אותות נודדים 25, פתח שיטה לתמונת תאים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי שנודדים בסביבה עם שיפועים דבקים ומסיסים מתחרים (איור 1). רצועות דבקות שהכילו streptavidin ניאון וRGD biotinylated נוצרו עם רצועות microcontact המודפסות ולטבול יתוגרפיה העט (איור 2). הדפסת microcontact מוצלחת מצוינת על ידי קו הפרופיל של עוצמת הקרינה שבו חוצה את מסילת פסי דבק ואזורים אנטי עכירות יכולים בבירור ניתן להבדיל (האיור 2b). הנקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו משמשים מכשיר microfluidic זמין מסחרי (דביקת שקופיות Chemotaxis 3D מIbidi) כדי לחקור את ההשפעות של משטחי שינוי כימי והדרגות chemoattractant על ​​נדידת תאים. התקנת microfluidic זה אינה דורשת זרימה בגלל השיפוע הוא הוקם על ידי דיפוזיה לאורך הערוץ. זה חשוב כי תזרים יכול להשפיע באופן דיפרנציאלי תאים נודדים לאט כגון פיברובלסטים שיוצרים הידבקויות מוקד יציבות ותאים נודדים מהירים כמו רוב leukocytes שיוצרים מתחמי מוקד קטנים וסינפסות 26. מאמץ גזירה מהזר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו אינטרסים מסחריים כדי לגלות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מכירים במימון מהמועצה למחקר האוסטרלית והבריאות הלאומיות ומועצה למחקר הרפואי של אוסטרליה וגם רוצים להודות המתקן הלאומי באוסטרליה ייצור עבור SU-8 האב להדפסת microcontact. SHN נתמך על ידי משרד חינוך הגבוהה למלזיה וUniversiti Sains מלזיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תלבושות מכתים מזכוכיתכיסוי תומס סיינטיפיק8542 E40מתלה
לתנורקלסרED 53 פרוסת
סיליקוןקווסט708-007בורון מסומם < 100> רקיק, קוטר 4 אינץ', 500 μ m, צד יחיד מלוטש
GM1070 SU-8 פוטו-רזיסטGersteltec Sarl
SU-8 מפתחGersteltec Sarl
Sylgard 184 חומר ריפויDow Corning
Sylgard 184 אלסטומר prepolymerDow Corning
PLL-PEG-biotin (20%)SuSos AGPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-ביוטין (20%)1 מ"ג/ מ"ל ב-PBS
FluoresceinSigma469551 מ"מ ב-PBS
Streptavidin-AlexaFluor350InvitrogenS-112491 מ"ג/מ"ל ב-PBS
ביוטין-4-פלואורסצאיןInvitrogenB-13700.03 μ g/μ l ב-PBS
Biotin-RGDGenScriptSC12080.03 מ"ג/מ"ל ב-PBS
Syto 64 RedInvitrogenS-113461 μ M in PBS
Sticky slide chemotaxis 3DIbidi80328
200 μ l גריינר קצה משופע צהובGreiner Bio-One739261
וזליןסיגמא16415
שעוות פרפין, mp 55-57 ° CSigma327204
Nano eNabler 10 μ m שלוחה BioForceSPT-S-C-10s
Image J תוכנההמכון הלאומי לבריאותrsbweb.nih.gov/ij/download.html
תוסף מעקב ידניFabrice Cordeliè resrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration ToolIbidi GmbHwww.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html
תנור סיליקון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271(2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Adhesive GradientSoluble GradientMicrofluidic ChamberPLL PEG PassivationMicrocontact PrintingDip Pen LithographyStreptavidin PatterningBiotinylated RGDFBS GradientLive Cell Imaging

מאמרים קשורים