הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

סיכום

בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.

תקציר

הבנת הפיסיולוגיה של התא של מעגלים עצביים המווסתים את ההתנהגויות מורכבות היא מאוד משופרת באמצעות מערכות מודל שבו ניתן לבצע את העבודה הזאת בהכנת מוח שלמה שבו המעגלים העצביים של מערכת העצבים המרכזית נשארים שלמים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי במוח שלם. יש דגי אוכלוסיות מרובות של נוירונים GnRH, והפונקציות שלהם הן ​​תלויות במיקומם במוח ובגן GnRH שהם מביעים ^1. יש לנו התמקדנו בהפגנה שלנו GnRH3 נוירונים הממוקמים בעצבי המסוף (TN) בקשר לנורות חוש הריח באמצעות המוח שלם של דגי medaka מהונדס (איור 1B ו-C). מחקרים מראים שנוירונים TN-GnRH3 Medaka הם neuromodulatory, מתנהגים כמו משדר של מידע מהסביבה החיצונית למערכת העצבים המרכזית; לאהיי לא משחק תפקיד ישיר בויסות תפקודי יותרת המוח, האשכים, כפי שעושה נוירונים ההיפותלמוס GnRH1 הידועים ^{2, 3.} דפוס טוניק של ירי פוטנציאל פעולה הספונטני של תאי עצב TN-GnRH3 הוא מאפיין מהותי ^4-6, התדירות מתוכם הוא מווסת על ידי רמזים חזותיים מקונספציפים ² ו kisspeptin 1 ⁵ נוירופפטידים. בסרטון הזה, אנו משתמשים בקו יציב של מהונדס medaka בי נוירונים TN-GnRH3 להביע transgene המכיל את האזור המקדם של Gnrh3 קשור לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ⁷ להראות לך איך לזהות ולעקוב אחר פעילות נוירונים החשמלית שלהם במוח כולו הכנת ^6.

פרוטוקול

1. נתיחה של מוח מהמבוגרים Medaka

1. הרדימי מבוגר זכר או נקבה (איור 1 א) על ידי טבילה ב5 מיליליטר MS-222 (150 מ"ג / ל ', pH 7.4); לחכות כמה דקות אחרי תנועות זימים הפסיקו לפני עריפת הראש. כל ההליכים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.
2. לערוף את הדגים במלח דגים בסוף הזנב של operculum עם מספריים בצלחת פטרי בקוטר של 60 מ"מ.
3. העברת ראש דג לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ, חצי מלא בדגים מלוחים ומרופד בSylgard שיש לו דיכאון בזה כדי למקם ולאבטח את הראש לנתיחה המוח. עמדה ולאבטח את הגב בצד הראש עם סיכות חרקים.
4. לחתוך בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת מסביב שלה עם מספריים עדינים ובעדינות להסיר אותו עם מלקחיים, חושף חלק הגבי של המוח כולל את החלק הקדמי של חוט השדרה לחלוטין.
5. הרם את חוט השדרה בעדינות עם מלקחיים עדין קצה ולנתק את עצבי חיבור בין שתי המדינות במספריים קנס שקצהו: עצבים גולגולת, עצבים בעמוד השדרה, ואת עצבים ראייה בצד הגחוני של המוח, ואת עצבי חוש הריח בחלק הקדמי של המוח.
6. מניחים את המוח גזור באופן מלא בצלחת פטרי טרי מלאה מלוח דגים, ולבדוק בזהירות מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את המוח כולו הוא ללא פגע (כולל בלוטת יותרת המוח), ללא חתכים או נקבים. מוח שנפגע אינם משמש לניסויים.

2. ההרכבה המוח בתא הקלטה

1. מקום טיפה קטנה של cyanoacrylate או דבק מהיר משחק אחר עם מחט לתוך מרכז חדר ההקלטה ולהפיץ את הדבק על 1 ס"מ ^2.
2. מהר להעביר את המוח ואותו הדבק בעמדה עד הגחון בצד.
3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת מלח דגים, כך שהוא ממלא את חדר ההקלטה ומכסה את המוח. ברציפות perfuseהמוח עם מי מלח דגי מוגזים בשיעור של לפחות 200 μl / דקה.
4. באמצעות קצה מלקחיים עדין להסיר את קרומי המוח בזהירות מעל פני השטח של אזור ההקלטה של ​​המוח.

3. Electrophysiology

1. הקלטת תיקון רופפת של ירי פוטנציאל פעולה
   1. microelectrodes הזכוכית (6-10 MΩ) בנויים מpipettes זכוכית ורוסיליקט (1B150F-4, מכשירי עולם Precision) באמצעות חולץ אלקטרודה (למשל סאטר P-87), ומילא חזרה עם פתרון ההקלטה רופף-התיקון בחץ הדרך למעלה האלקטרודה.
   2. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם מכשיר תשלום מצמיד מקורר (CCD) מצלמה, למצוא את ה-GFP-לבטא TN-GnRH3 הנוירונים באמצעות 10x (איור 1), ולאחר מכן מטרות טבילה במים 40X (איור 1 ג). הם ממוקמים ליד או על פני השטח הגחון של נורות חוש הריח, רק הקדמיים לtelencephalon.
   3. לעבור לצג וידאו שמספקתמונות בזמן אמת ממיקרוסקופ כדי לאתר את TN-GnRH3 נוירון האשכול (איור 1 ג').
   4. מקם את microelectrode לאמבטיה, כך שהקצה של האלקטרודה הוא מעל ליעד נוירון. להפעיל לחץ חיובי קל מתמיד microelectrode כך שזה לא ייסתם, ומתקרב בעדינות נוירון היעד עם הקצה של האלקטרודה.
   5. לבדוק ולפקח על התנגדות האלקטרודה במצב מתח מהדק באמצעות תוכנת AxoGraph ומגבר Axoclamp 200B עם תוכנת Axograph (אקסון מכשירים). כאשר אתה יכול לראות מהצג וידאו שהקצה של האלקטרודה הוא על פני השטח של תא העצב ומתצוגת AxoGraph שההתנגדות משתנה במקצת, שחרר את הלחץ החיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל אם יש צורך לעשות חותם על התנגדות נמוכה נוירון (<100 MΩ).
   6. מעבר למצב נוכחי, מהדק, ולהקליט את מתח הקרום ברציפות ללא כל קלט נוכחי, כדי להתאים את קנה המידהשל מתח וקצב ההקלטה במידת צורך. הנתונים שנאספו ונותחו על ידי תוכנת Powerlab (ADInstruments Inc).
   7. פעילות שיא הבסיס חשמלית בתמיסת מלח דגים רגיל לכ -5 דקות לפני כל טיפול (איור 2 א). זלוף אמבט של תרופות, הורמונים, פפטידים, וכו '. הוסיף מלח לדגים ממשיך בשיעור של 200 μl / דקות, ואחרי תקופה בכישלון רגיל דגים מלוחים ^{5, 6, 11.}
2. הקלטת תא שלמה של פוטנציאל הממברנה
   ההליך כולו מהדק תיקון תא electrophysiology הוא זהה לזה של הליך ההקלטה רופף-תיקון תאי שתואר לעיל, משלבים 3.1.1 - 3.1.4. ואז את ההליכים לסטות בהתאם:
   1. לבדוק ולפקח על התנגדות האלקטרודה במצב מתח מהדק. כאשר אתה יכול לראות מהצג וידאו שהקצה של האלקטרודה הוא על פני השטח של תא העצב ומאוסצילוסקופ כי שינויי ההתנגדות מעט, שחררו את חיובייםלחץ ולהחיל לחץ שלילי קטן כדי להפוך את חותם עמידות גבוהה בנוירון (~ 3 גיגה Ω). החל שאיבה עדינה דרך פה לקרע קרום הטלאים, אתה תראה ירידה פתאומית של ההתנגדות לכ 120-250 MΩ.
   2. מעבר למצב נוכחי, מהדק, ולהקליט את מתח הקרום ברציפות ללא כל קלט נוכחי, כדי להתאים את קנה המידה של מתח וקצב ההקלטה במידת צורך.
   3. פעילות חשמלית בסיסית בשיא מלוח דגים רגילים לכ -5 דקות לפני כל טיפול, כפי שתוארה לעיל ב3.1.7 (איור 2).

תוצאות

דוגמה של אשכולות בין שתי המדינות של ה-GFP שכותרתו GnRH3-TN נוירונים מהמוח של דגים נכרת medaka מוצגת ב1B 1C ודמויות. כל אשכול מכיל כ 8-10 נוירונים GnRH. את הפעילות העצבית הספונטנית של יעד TN-GnRH3 נרשמה במצב נוכחי מהדק (אני = 0) עם שיעורי ירי טיפוסיים של 0.5-6 הרץ. הדפוס של ירי פוטנציאל פעולה הוא בדרך כלל דפוס טוניק או להכות, עם מרווח interspike קבוע למדי. עקבות לדוגמה מוצגות באיור 2 (2 א: רופף-תיקון; 2B: כל התא).

דיון

GnRH 3: דגים מהונדסים GFP לספק מודלים ייחודיים כדי לחקור את המנגנונים שבבסיס neurophysiological אינטגרציה ורגולציה בשליטה מרכזית של התנהגויות שהן גם ישירות ובעקיפין מעורבות ^{ב3 רבייה, 8-10} עצביים. אחד היתרונות המשמעותיים של מערכת מודל זה הוא שהרבה GnRH3 נוירונים להביע GFP קרובים אל פני השטח הגחון של המוח, המאפשרים גישה קלה יחסית לתאי העצב להקלטת אלקטרו מבלי לשבש מעגלים עצביים ^{6, 9, 11, 12} (איורים 1B ו1C; 3A ו 3 דמויות).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ	אולימפוס		BX50W (זקוף)
מגבר	Axon Instruments		Axoclamp 200B
ממיר A-D	Interference Corp.		Digidata ITC-18
מצלמת CCD מקוררת	PCO אופטיקה		Sensicam
מנורת קסנון	Sutter Instruments Co.
סט מסנני GFP	Chroma Technologies
Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations		Slidebook Software
Electrophysiology Data Acquisition Software	Axon Instruments		Axograph
Software Electrophysiology Data Acquisition	Software AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage לאלקטרופיזיולוגיה	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-285
פלטפורמת תא הקלטה	Warner Instrument Corp.		חדר
הקלטות	וורנר אינסטרומנט קורפ		RC-26G
חולץ אלקטרודות	מכשירי		P87
נימה לחולץ אלקטרודות	מכשירי סאטר	FB330B	נימה שוקת רחבה 3.0 מ
"מ 1.5 מ"מ נימי זכוכית	מכשירי דיוק עולמיים	1B150-4	Micr– לקטרודה להקלטת
מזרק	בקטון דיקינסון	309586	3 מ"ל
MS-222	Sigma	E10521-10G	אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט
דגים			מ"מ: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10
תמיסת אלקטרודה HEPES (תיקון רופף)			מ"מ: 150 NaCl; 3.5 ק"ל; 2.5 CaCl<תת>2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10
תמיסת אלקטרודות גלוקוז (תיקון תא שלם)			מ"מ: 112.5 K-גלוקונאט; NaCl; 17.5 ק"ל; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 מגה-ATP; 1 EGTA; 10 HEPES; יציאת GTP אחת; 0.1 לאופפטין; 10 פוספו-קריאטין