הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

14.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50325

⸱

26 במרץ 2013

 ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Boston University , 2Department of Biomedical Engineering, Boston University

במאמר זה

סיכום

שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

תקציר

אבחון מהיר ויעיל, לשחק תפקיד חשוב בשליטה על מחלה זיהומית ומאפשר ניהול יעיל מטופל וטיפול. כאן, אנו מציגים שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב עם היכולת להגביר שפעת וירוס במטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates. בעקבות טעינת מדגם המטופלים, מכשיר microfluidic רצף מבצע תמוגה על שבב תא, טיהור רנ"א וצעדים בתוך ריכוז המיצוי המוצק השלב (SPE), שעתוק לאחור (RT) ותגובת שרשרת פולימרז (PCR) בRT-PCR תאים, בהתאמה. איתור נקודת סיום מתבצע באמצעות Bioanalyzer את השבב (Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה). עבור ציוד היקפי, השתמש משאבת מזרק יחידה לנהוג מגיבים ודגימות, בעוד שני תנורי סרט דקים שמשו את המקורות החומים לRT-PCR והתאים. השבב נועד להיות שכבה אחת ומתאימה לייצור תפוקה גבוהה, כדי לצמצם את fabricatiעל זמן ועלות. שבב microfluidic מספק פלטפורמה לניתוח מגוון רחב של וירוסים וחיידקים, מוגבלים רק על ידי שינויים בעיצוב מגיב הדרושים כדי לזהות פתוגנים עניין חדשים.

מבוא

מיליוני מקרי מוות דווחו בשלוש מגיפות השפעת של המאה ה -20 1. יתר על כן, מגיפת השפעת האחרונה הוכרזה על ידי ארגון הבריאות העולמית (WHO) 2 בשנת 2009, והחל מיום 1 באוגוסט 2010, 18449 מקרי מוות שדווח על ידי ארגון בריאות עולמית 3. מגיפה זו הוכיחה שוב את הניטל הגבוה של מחלות זיהומיות, ואת הצורך בזיהוי מהיר ומדויק של שפעת כדי לאפשר אישור מהיר מחלה, תגובה לבריאות הציבור מתאימה וטיפול יעיל 4.

ישנן מספר שיטות נפוצות לאבחון שפעת, אלה כוללים immunoassays מהיר, בדיקת האנטיגן ניאון ישירה (DFA) ושיטות תרבות ויראליות. immunoassays ראפיד דרמטי חסר רגישות 5-8, בעוד שתי שיטות האחרות הן עתירות עבודה וזמן רבים 9. בדיקות מולקולריות להציע יתרונות רבים, כולל תפנית הזמן sensit קצר, גבוהלקוחים, וסגולי גבוהים יותר. כמה גופים מסחריים כבר עובדים לקראת בדיקות מולקולריות מהירות (הנקרא גם בדיקות או NATS חומצות גרעין) למחל זיהומיות, וכמה יש מבחני שפעת בצינורות שלהם. עם זאת רובם דורשים הכנת מדגם את השבב. אף אחד מתיקוני הרפואה ו( CLIA) ייתרו בדיקות מולקולריות לשלב הכנת מדגם לתוך מחסנית assay או מודול.

טכנולוגיית מעבדה על השבב משחקת תפקיד חשוב בפיתוח של מכשירי בדיקת נקודה של טיפול. לאחר המבוא של שבב ה-PCR לראשונה בשנת 1993 10, מאמצים רבים שהושקעו בפיתוח שבבי בדיקת חומצות גרעין. עם זאת, רק מעטים מהם יש הכנת מדגם גולמית משולבת עם הגברה במורד זרם.

אנחנו הוכחנו בעבר את המזעור של עמודת מיצוי שלב מוצקה (SPE) לתוך שבב microfluidic פלסטיק 11 ולפתחment ואופטימיזציה של שבב ה-PCR זרימה רציפה 12. כאן, אנו מרחיבים את העבודה הקודמת לשלב SPE בצעדי PCR RT ולתוך שבב יחיד לאבחון קליני ולהפגין את יכולתה להגביר חומצות גרעין ממטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ייצור שבבים 12

  1. להפוך את שני לוחות מכדורי Zeonex 690R: להפיץ 8-9 כדורי Zeonex גרם באופן שווה במרכז לוחית מתכת, מחממים על העיתונות המחוממת בעמ '198 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט ל2,500 psi למשך 5 דקות נוספות. כדי להשלים שלב זה, השתמש עיתונות חמה קארבר.
  2. בלטת microfluidic הערוץ בשלט עם עובש אפוקסי. פרטים על ייצור העובש מתוארים במקום אחר 12 (עיצוב ערוץ באיור 2b): לשים שלט אחד על עובש אפוקסי; מחמם אותם בעיתונות המחוממת ב157 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט לpsi 1000 למשך 10 דקות נוספות . הסרת הפלאק מהעובש ביד או באמצעות מלקחיים לפני שהיא מתקררת. (שים לב: ללבוש כפפות תרמיות בשלב זה).
  3. לקדוח חורים בשבב הבולט בכניסה, יציאת פסולת, והיציאה של ערוץ microfluidic. אנחנו השתמשנו בקוטר 1.25 מ"מeter מקדח להפוך את השלושה חורים.
  4. ונד שבב המובלט עם שלט אחר (על גבי): לשטוף את השבבים עם IPA, RNAse הרחק ובמי deionized ברצף; אוויר יבש ומחמם אותם בעיתונות המחוממת ב131 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן קש על 350 psi לעוד 10 דקות.
  5. צרף Nanoports בכניסה, הפסולת, ואת היציאות לשקע בנפרד באמצעות JB הוולד אפוקסי; לרפא במשך 15 עד 24 שעות לפי הוראות היצרן.
  6. שטוף את ערוץ SPE עם 50 RNAse חוץ μl, אחריו עם מי nuclease חופשיים μl 100.
  7. טען את ערוץ SPE עם 4 μl של פתרון ההשתלה (methacrylate תיל עם 3% w / v benzophenone) ולאחר מכן Crosslink methacrylate ידי דוגר למשך 10 דקות בתנור UV תחת אורך גל 365 nm UV ו2000 mJ / 2 סנטימטר. הסר את פתרון השתלת שיירים עם ואקום. אנחנו נצלנו את חלל הריק הקיר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, פתרון טרי צריך להיות בשימוש. זה בדרך כלל מקובל, עם זאת, כדי לאחסןפתרון מוכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
  8. הפוך פתרון SPE העמודה (כל% v / v): 16% dimethacrylate אתילן, 24% methacrylate וטיל, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol, ולהוסיף 1% -2 dimethylamino-4-(מתיל phenylamino)-פנול כצילום יוזם.
  9. קח את אותו הנפח של תמיסת microspheres סיליקה כפתרון עמודת SPE (כדי להפוך תערובת ביחס 1:1), ולייבש אותו לחלוטין ב 70 מעלות צלזיוס למשך לילה בתנור ואקום. לשבור את הכדור על ידי קשה על הצינור עם המכסה הסגור. הוסף פתרון עמודת SPE לתוך הצינור המיובש סיליקה microsphere והמערבולת לערבב.
  10. טען 4 μl של פתרון SPE לאותו ערוץ ולאחר מכן Crosslink זה על ידי הקרנת UV במשך 2.5 דקות. ואז, להפוך את השבב מעל ולהקרין תמורת 2.5 דקות נוספות. טור SPE polymerized צריך להיות מוצק לבנה אטומה.
  11. לשטוף את הערוץ עם 500 μl של מתנול 100% לשטוף מעל מגיבים עודפים. לשטוף זה גם מסיר תוך פולימר פוממסי rogenic, ובכך ליצור מבנה הנקבובי הפתוח של עמודת SPE כאשר התייבשו בתנאי הסביבה.
  12. צרף שני תנורים, סרט דק לחלק התחתון של השבב עם קלטת מוליכי תרמית. את הצדדים של תנורי החימום צריכים להיות מיושרים עם הקצה של הערוצים הרחבים לdenaturation וחישול בנפרד (ראה תרשים 1).
  13. 5 צמדים תרמיים מקום לשבב דרך מת הסתיימו ערוצי צד פתוחים של כל שבב (ראה איור 2b). את הצמדים התרמיים להישאר בערוצים אלה באמצעות התאמת עיתונות. קלטת שמשה כדי לתקן את המיקום של צמדים תרמיים נוסף.

2. שיטת חילוץ שלב מוצקה

  1. הכן 96 μl של אתנול 70% במים DEPC שטופל וautoclaved (deionized או Millipore בפילטר).
  2. 4 μl הוסף של רנ"א 25X Secure עד 96 μl של אתנול 70% בצינור אחד, ולשכפל את אותה תערובת עם אתנול 100% בצינור נפרד.
  3. הכן 300μl של חיץ ערוץ על ידי ערבוב הבא: 75 μl של thiocyanate ז 6 guanidine (GuSCN), 150 μl של 2-propanol, 63 μl מים חופשיים nuclease, ו12 μl של רנ"א Secure 25X.
  4. הכן 312 μl של חיץ תמוגה ידי ערבוב: 100 μl של 6 מ'GuSCN, 200 μl של 2-propanol, ו12 RNA 25X μl המאובטח.
  5. מחמם אתנול 70%, 100% אתנול, חיץ ערוץ ומאגרי תמוגה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות כדי להפעיל RNA המאובטח.
  6. כדי לאזן את ערוץ microfluidic, הפעל את חיץ הערוץ דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ"ל / שעה.
  7. מהיר להפשיר מדגם הבדיקה בVTM על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, והסר את המדגם באופן מיידי מאמבט מים ברגע שהוא מופשר.
  8. צנטריפוגה המדגם ב 13000 סל"ד למשך 10 דקות, ולהעביר 100 μl של supernatant לתוך 300 μl של חיץ תמוגה. השלם את התערובת על ידי הוספת 6 μl של מיקרוגרם 1 / רנ"א המוביל μl.
  9. מערבולת לערבב, ואחרי סיבוב כבר5 שניות, טענו כל lysate לתוך מזרק סמ"ק luer-Lok 1.
  10. הפעל lysate דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ"ל / שעה.
  11. שטוף את ערוץ SPE עם 100 μl של אתנול 70%, ואחריו אתנול 100% μl of100 ב1 מ"ל / שעה. (יש נפח מת μl 50 שבקצה המזרק שלא ידחק אותי החוצה, ולכן למעשה רק 50 μl עובר ערוץ.)
  12. מקם מזרק ריק בסימן 0.5 המ"ל ולדחוף אוויר דרך הערוץ כדי לייבש אותו ב1 מ"ל / שעה.
  13. הפעל 67.5 μl מי nuclease חינם דרך הערוץ לelute את חומצות גרעין הקשורות ברמה של 0.5 מ"ל / שעה, ולאסוף μl 13.5 מnanoport בנמל הפסולת. (איבוד הנוזלים בשל הנפח המת μl 54 שבקצה המזרק וערוץ SPE).

3. RT-PCR

  1. הכן 36.5 μl של מיקס מאסטר RT-PCR במהלך השלב היבש האוויר (2.12) תוך שימוש בחומרים הכימיים בתוך ערכות OneStep Qiagen RT-PCR.
  2. טען RT-PCR מגיב בnanoport בנמל הפסולת, ולערבב עם רנ"א כדי לקבל את התגובה הבאה 50 μl RT-PCR: 13.5 רנ"א eluted μl במי nuclease חופשיים, 4 תמהיל האנזים μl RT-PCR, פתרון ש 10 μl, 10 μl1X 1 חיץ צעד, 2 25 מ"מ μl MgCl 2, 1 פריימר 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 '50 מיקרומטר μl קדימה, 1 מיקרומטר פריימר μl 50 הפוך 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', DNTP 2 μl, 1.0% μl 0.75 w / v BSA, 0.73 μl PEG8000 ומי nuclease חופשיים μl 5.02.
  3. טען את תערובת RT-PCR לתוך ערוץ RT ידי ואקום עדין (השתמשנו בואקום הקיר) ולאטום Nanoport עם הולם סגורה.
  4. החל 35 V לדוד 1. שמור את ריאגנטים בערוץ RT למשך 30 דקות לאחר החימום 1 equilibrates ב 50 ° C. שמור את ריאגנטים בערוץ RT במשך 15 דקות לאחר ש1 equilibrates הדוד ב 95 ° C.
  5. החל 27 V לתנור 1 ו 50 V לדוד 2, להמתין כשלוש דקות או עד 1 equilibrates דוד בגיל 60 ודהז; C ומחמם 2 equilibrates ב 95 ° C.
  6. דחף את ריאגנטים לערוץ ה-PCR על 0.5 μl / דקה. זה אמור לקחת 20 דקות לריאגנטים לזרום דרך התעלה המפותלת.
  7. כמדגם הופך אותו לסוף הערוץ המתפתל, לאסוף את מוצרי ה-PCR בשקע באמצעות pipettor וקצה בגודל המתאים.

4. איתור מוצרי PCR

  1. אנו משתמשים במבחן Agilent רגישות גבוהה DNA כדי לזהות את המוצרים. כדי להפעיל את המבחן הזה מוציא את ערכת DNA רגישות הגבוהה Agilent ממקרר 30 דקות לפני הבדיקה.
  2. הפעל Bioanalyzer ולפתוח את תוכנת המומחה 2100.
  3. טען μl 1 של מוצרי ה-PCR לבדיקות והמעקב Agilent הפרוטוקול (20Manual.pdf% http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent).
  4. לנתח ולתעד את הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאה טיפוסית מוצגת באיור 3 לשפעת דגימת שטיפת אף ולוע נגועה. בשל כמויות השונות של נגיף שפעת בכל דגימת מטופל, הריכוז הסופי של מוצר PCR ישתנה. תוצאה טובה צריכה רעש נמוך, שני שיאי סולם ברורים (35 ו10380 נ"ב) ושיא מוצר אחד בגודל המוצר מיועד (107 נ"ב) למדגם החיובי. אמנם שיא המוצר צריך להיות באופן תיאורטי נעדר בקרות שליליות, עשה להתבונן פסגות PCR מזויפות ליד מוקד שפעת הספציפית מהיווצרות פריימר-הדימרים בכמה דוגמאות. פסגות מוצר מרובות משקפות אפשרות של זיהו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטת האבחון שהוצגה כאן הדגימה את היכולת של שבב microfluidic פלסטיק משולב כדי להגביר שפעת RNA מן דגימות מטופל עם סגוליות גבוהות וגבול גילוי נמוך 13 עצבנו השבב הזה לנקודת פוטנציאל של בדיקות טיפול:. (א) את הטמפרטורה וfluidic השליטה הייתה פשוטה יותר, (ב) את השבב הוא עלות נמוכה ומתאימה לייצור תפוקה גבוהה באמצעות הזרקה, ו (ג) את השבב הוא חד פעמי ומיועד לשימוש חד פעמי, וכך להקטין את החשש לזיהום צולב דגימה.

למ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים הכריזו אין אינטרסים כספיים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענק R01 EB008268.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב / חומרים חברה מספר קטלוגים
1-dodecanol סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 443816-500G
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 196118-50
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה G2943CA
2-Propanol סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 19516
Benzophenone סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 239852-50
BSA תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית A7979-50ML
methacrylate וטיל סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 235865-100 מ"ל
רנ"א Carrier Qiagen, ולנסיה, קליפורניה 1017647
Cyclohexanol סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 105899-1L
אתנול סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי E7023
dimethacrylate אתילן סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 335861
dimethacrylate אתילן גליקול סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 335681-100 מ"ל
250 μl מזרק הזכוכית המילטון, רינו, NV 81127
thiocyanate guanidine סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 50981
ערכת ה-DNA רגישות גבוהה Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה 5067-4626
עיתונות חמה קארבר, Wabash, IN 4386
JB epoxies הוולד מקמאסטר-CaRR, Elmhurst, IL 7605A11
מזרקי luer-Lok BD-רפואי, פרנקלין אגמים, ניו ג'רזי 309628
מגנזיום כלוריד תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית AB-0359
מתנול סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 494437
methacrylate תיל סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי M55909
Nanoport אפצ'רץ' מדעי N-333-01
Nanoport התאמה אפצ'רץ' מדעי ה-F-120x
מי nuclease חופשיים תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית PR-P1193
OneStep RT-PCR ערכה Qiagen, ולנסיה, קליפורניה 210210
PEG8000 סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 41009
אספקת חשמל VWR, רנדור, הרשות פלסטינית 300V
RNAse חוץ סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי 83931-250 מ"ל
RNASecure אפלייד Biosystems, הפוסטר סיטי, קליפורניה AM7005
סיליקה microspheres Polysciences, ורינגטון, הרשות פלסטינית 24324-15
משאבת מזרק הרווארד Apparatus, Holliston, MA HA2000P/10
קלטת מוליכי תרמית מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL 6838A11
צמד תרמי אומגת הנדסה, סטמפורד, קונטיקט 5SRTC-TT-J-40-36
מחממי סרט דק Minco, מיניאפוליס, מינסוטה HK5166R529L12A
Crosslinker אולטרה סגול UPV, Upland, קליפורניה CL-1000
Zeonex Zeon כימיקלים, Louisville, KY 690R

מקורות

  1. Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
  2. WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
  3. WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
  4. Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
  5. Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
  6. Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
  7. Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
  8. Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
  9. Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
  10. Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
  11. Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
  12. Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
  13. Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176(2012).
  14. Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
  15. Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
  16. Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNABioanalyzer
ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.